| **특허1>등록특허 10-0383529 프로테옴 이미지 마이닝을 이용한 암 질환 분석 방법 및 시스템<2002년10월31일>
---암특이적 진단마커 동정 및 최적의 암진단마커 패널 구성의 방법론 설정 및 분석시스템 개발에 대한 특허임
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(특허 요약 원문)
본 발명은 이미지 마이닝 기법에 의해 혈청 프로테옴의 표본을 생성하고 이를 이용하여 암 질환 여부를 확인할 수 있는 암 질환 분석 방법 및 이를 이용한 시스템을 제공한다. 또한 본 발명은 암 진단에 사용하는 암 특이적 진단 마커를 제공한다.
본 발명의 암 질환 분석 방법은 정상적인 개체 및 질환을 가진 개체의 혈청 프로테옴을 2D-Gel을 이용하여 2차원 이미지화한 후, 이를 이미지 마이닝 기법을 적용하여 혈청 프로테옴 표본으로 데이터베이스화하는 과정, 분석 대상 혈청프로테옴을 입력받아 이미지화한 후 데이터베이스에 저장된 혈청 프로테옴 표본과 비교하여 암 질환 여부를 판단하는 과정을 포함한다.
또한, 본 발명의 암 질환 분석 시스템은 다수의 정상 개체 및 암 질환 개체로부터 채취한 혈청 프로테옴을 입력받아 2차원 이미지로 변환하여 특징을 추출하고, 특징 데이터 중 최적의 특징 데이터를 식별하여 프로테옴 표본을 생성하는 한편, 분석 대상 혈청 프로테옴을 2차원 이미지로 변환하고 특징을 추출하기 위한 프로테옴 표본 생성 수단, 프로테옴 표본 생성 수단에 의해 추출된 분석 대상 혈청 프로테옴의 패턴과 프로테옴 표본의 패턴의 유사 여부를 판단하기 위한 프로테옴 비교 수단, 프로테옴 비교 수단의 비교결과 분석 대상 혈청 프로테옴의 패턴이 정상인의 혈청 프로테옴패턴과 유사한 경우에는 분석 대상 혈청 프로테옴을 정상으로 판단하고 그렇지 않을 경우에는 암 질환이 발병한 것으로 판단하기 위한 질환 분석 수단을 구비한다.
이와 같은 암 질환 분석 방법 또는 시스템에 의하면 다양한 혈청 프로테옴을 이미지 마이닝 기법을 적용하여 데이터베이스화하고, 분석 대상 혈청 프로테옴을 프로테옴 표본과 비교함으로써 암 질환 발병 여부를 용이하게 확인할 수 있다.
((***본 특허의 의의))
==암질환에 특이적인 암진단마커들을 찾기 위해 정상인 대비 암환자의 혈청 프로테옴을 2D-Gel을 이용하여 2차원적으로 배열하여 서로 구별되는 특징적 차이를 찾아내고, 그중에서도 최적의 특징 데이터를 식별, 이를 이미지마이닝 기법을 적용해서 혈청프로테움 표본으로 데이터베이스화 해 놓은 후 ((즉, 이것들이 암특이적 진단마커이다!!)), 분석하고자 하는 혈청의 프로테옴을 입력받아 2D 이미지화 하여 기존의 데이터베이스에 저장된 암환자의 혈청프로테옴과 비교해서 암질환의 특징을 가지는지, 아니면 정상인의 혈청 프로테옴패턴인지를 판단하는 시스템을 개발, 실용화 한 최초의 특허임<2002년10월31일>
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((용어))
**이미지 마이닝(엄청난 용량의 데이터중에서 목표로 하는 가치있는 데이터들을 찾아 발견하는 프로세스)
**프로테옴(유전체, 세포, 조직, 미생물 유래 단백질).....
--<전략>
-본 암진단 연구 특허 그 이전까지는, 연구자들이 모두 질량 분석법(SELDI-TOF 또는 MALDI-TOF)을 이용하여 1차원의 분석패턴으로 정상인의 혈청 단백질과 구별되는 암 환자의 혈 청 단백질을 찾아내어 이를 암 질환 마커로 활용한 것들이며, 이는 정상인의 혈청 단백질과 구별되는 암 환자의 혈청 단백질을 구별하기 위해서는 질량이라는 하나의 요소(factor)만을 판단의 기준으로 하고 있고, 수많은 혈청 단백질의 변화 양상과 그 변화 정도를 고려하여 선별하여야 하는 바, 암 진단의 정확성이 떨어질 뿐 아니라 경제적이지 못한 면이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기의 연구의 문제점을 극복하고, 질환의 진단의 정확성을 높이면서도 경제적이며, 의사뿐 아니라 환자에게도 빠르고 간편한 방법으로 누구나 이용할 수 있는 질환 진단 방법을 연구한 결과, 혈청 시료를 2차원으로 분리시킴으로써 변화된 단백질을 더 용이하게 구분할 수 있도록 혈청 단백질의 2D-Gel 분리 상태를 이미지로 변환하여, 이미지 마이닝 기법에 의해 각 질환에 특이적인 혈청 프로테옴의 표본(프로테옴 패턴)을 생성하고, 이를 이용하여 암 질환을 진단하고 분석할 수 있는 간편하고 경제적인 방법 및 시스템을 제공하게 되었다.
---본 발명에서 사용된 "프로테옴 패턴"은 정상 개체의 혈청 샘플과 비교하여 어떤 질환을 가진 개체의 혈청 샘플에서 구별되게 존재하는 폴리펩타이드의 특징적인 그룹 또는 그룹핑되는 형태를 의미한다. 즉, 특정 질환의 경우에 특이적으로 변화 양상을 나타내는 혈청 단백질의 그룹 또는 이들의 2차원에서의 위치 형태를 등을 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용된 "질환 특이적 프로테옴 패턴"은 특정 질환에 따라 특이적으로 나타나는 혈청 단백질의 그룹 또는 이들의 그룹핑 형태를 말한다. 이는 본 발명의 방법 및 시스템의 질환 판별의 마커로 사용된다.
본 발명에서 사용된 "특징 데이터"는 정상 개체 및 질환 개체로부터의 혈청 프로테옴의 비교를 통해 질환 상태를 구별해 낼 수 있는 혈청 프로테옴들에 관한 데이터를 말한다. 구체적으로는 질환 상태의 혈청 2차원 이미지에 특이적으로 존재하는 혈청 프로테옴에 해당하는 스팟들의 데이터를 포함한다. 예를 들면, 이는 스팟들의 그룹(조합), 각 스팟들의 질량 및/또는 등전점 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용된 "최적의 특징 데이터"는 상기 특징 데이터 중에서 질환을 특이적으로 판별해 낼 수 있는 최적의 데이터를 말한다. 구체적으로, 질환에 특이적인 스팟들의 조합 중에 서 최적의 조합을 포함한다.
본 발명에서 사용된 "데이터 마이닝"은 수많은 데이터 가운데 숨겨져 있는 유용한 상관 관계를 발견하는 것으로, 데이터베이스로부터 과거에는 알지 못했지만 데이터 속에서 유도된 새로운 데이터 모델을 발견하여 미래에 실행 가능한 정보를 추출해 내고 의사 결정에 이용하는 과정을 말한다. 즉, 데이터에 숨겨진 패턴과 관계를 찾아내어 정보를 발견해 내는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "유전자 알고리즘(GA)"은 자연계에 있어서 생물의 유전과 진화의 메커니즘을 공학적으로 모델화하는 것에 의해 생물이 갖는 환경에서의 적응능력을 취급하는 것으로, 풀고자 하는 문제에 대한 가능한 해들을 정해진 형태의 자료구조로 표현한 다음 이들을 점차적으로 변형함으로써 점점 더 좋은 해들을 생성해 내는 방법이다. 보다 구체적으로, 유전자 알고리즘은 어떤 범위 내에서 정의되어 있는 변수 x에 대한 함수f(x)의 최대치 또는 최소치를 이끌어 내는 x 값을 고속으로 구하기 위한 최적화 탐색 알고리즘의 일종이라고 할 수 있다. 유전자 알고리즘은 유전자요소를 기호열로 변환하는 코딩 작업을 수행하는 유전자형 결정 단계, 유전자형 결정 단계에서 결정된 유전자형으로 부터 요소가 다른 다양한 개체를 발생시키기 위한 초기 유전자 집단 결정 단계, 각 개체의 적응도를 미리 결정한 방법에 의해 연산하기 위한 개체의 적응도 평가 단계, 적응도 평가 단계에서 결정한 적응도에 기초하여 개체의 생존 분포를 결정하기 위한 선택 단계, 2개의 염색체 사이에서 유전자를 바꾸어 넣어 새로운 개체를 발생시키는 교배처리 단계, 유전자의 어떤 부분의 값을 강제적으로 바꾸고 유전자 집단으로서의 다양성을 극대화하여 보다 좋은 해를 가지는 개체가 발생되도록 하는 돌연변이 처리 단계, 각 개체의 적 응도 평가단계로 복귀하는 단계로 이루어진다. 유전자 알고리즘을 이용하게 되면 복수의 개체 사이에서 선택, 교배 등의 유전적 조작에 의해 상호 협력적으로 해의 탐색을 수행하기 때문에 단순한 병렬적 해의 탐색과 비교하여 보다 좋은 해를 발견하기 쉽고, 알고리즘이 단순하여 실시가 용이한 장점이 있다.
본 발명에서 사용된 "서포트 벡터 머신(SVM)"은 패턴 인식에 유용하게 사용되는 학습용 머신으로서, 결정되는 표면이 서포트 벡터 및 그에 대응하는 가중치의 집합으로 이루어지는 변수에 의해 결정되며, 다수의 변수를 각각 따로 취급하지 않고 동시에 처리하는 방법을 제시한 것을 의미하고, 이는 벡터를 분류하는 유용한 도구로 사용될 수 있다. 서포트 벡터 머신에 의하면 입력 공간의 비선형적인 높은 차수를 특징면(feature space)에서 선형적으로 투영하여 해석할 수 있도록 하며, 각 특징 사이의 최적의 경계(최적 분리면)을 제시한다. 서포트 벡터 머신은 크게 트레이닝 과정과 테스팅 과정의 두 부분으로 이루어진다. 트레이닝 과정에서는 서포트 벡터가 생성되며 테스팅 과정에서는 특정 규칙에 의한 판단이 수행된다.....<하략>
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***이번 순서는 다중암 사전검사로서 스마트암검사기법에 대한 기술 및 시스템 장치 발명 특허 상세입니다..
##특허18>>공개특허 10-2010-0139567 ((발명의 명칭))복합 바이오마커를 활용한 암 진단 정보 생성 방법, 및 암 진단 예측 시스템 장치<2010년12월30일 출원>
본 발명은 복수 개의 바이오마커별 발현량 정보를 변환하여 변환된 발현량 정보를 활용하는 복합 바이오마커를 활용한 암 진단 방법, 암 진단 모델 생성 방법, 암 진단 예측 시스템 및 바이오마커의 영향력 처리 방법에 관한 것이다.
본 발명을 활용하면, 단일 바이오마커에 비하여, 암 진단 능력이 높은 복합 바이오마커를 구성할 수 있으며, 이상치 등에 의한 암 진단 모델의 왜곡을 최소화할 수 있어, 암 진단 키트 및 암 진단 방법의 신뢰성을 높일 수 있다
===기 술 분 야
[0001] 복합 바이오마커를 활용한 암 진단 방법, 암 진단 모델 생성 방법, 암 진단 예측 시스템 및 개별 바이오마커의 영향력 처리 방법에 대한 것으로서, 복수 개의 바이오마커별 발현량 정보를 변환하여 변환된 발현량 정보를 활용하는 복합 바이오마커를 활용한 암 진단 방법, 암 진단 모델 생성 방법, 암 진단 예측 시스템 및 바이오마커의 영향력 처리 방법에 관한 것이다.
===해결하려는 과제
[0010] 본 발명이 해결하려는 첫번째 기술적 과제는 암 진단용 복합 바이오마커 정보를 활용한 암 진단 방법을 제시하는 것이다.
[0011] 본 발명이 해결하려는 두번째 기술적 과제는 복합 바이오마커를 활용한 암 진단 모델을 생성 방법을 제시하는 것이다.
[0012] 본 발명이 해결하려는 세번째 기술적 과제는 암 진단 예측을 수행하는 암 진단 예측 시스템을 제시하는 것이다.
[0013] 본 발명이 해결하려는 네번째 기술적 과제는 바이오마커별 변수값 처리 방법을 제시하는 것이다.
[0014] 본 발명이 해결하려는 다섯번째 기술적 과제는 복합 바이오마커에 대한 영향력 정보 처리 방법을 제시하는 것이다.
===과제의 해결 수단
[0015] 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 암 진단용 복합 바이오마커 정보를 활용한 암 진단방법에 있어서,
(A) 암 진단 대상자의 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 대상자의 신체에서 분리한 채취 물질로부터 복수 개의 개별 바이오마커별 발현량 정보 또는 적어도 한 쌍의 바이오마커별 발현량 비율 정보를 입수하는 단계;
(B) 상기 발현량 정보 또는 상기 발현량 비율 정보를 의사 결정 나무를 이용한 앙상블 방법의 partial dependency plot 내지는 partial dependency 함수 관계를 이용하여 변환하여 변환된 발현량 정보 또는 변환된 발현량 비율 정보를 생성하는 단계; 및
(C) 상기 변환된 발현량 정보 또는 상기 변환된 발현량 비율 정보를 기설정된 암 진단 모델에 입력하여 암 진단 정보를 생성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 복합 바이오마커 정보를 활용한 암 진단 방법을 제시한다.
[0022]본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 복합 바이오마커를 활용하여 상기 암 진단 모델을 생성하는 방법에 있어서,
복수 명의 암 환자와 복수 명의 정상인으로 구성되는 대상자를 대상으로, 대상자의 혈액, 혈장, 혈청 또는 기타 대상자의 신체에서 분리한 채취 물질로부터 복수 개의 바이오마커별 발현량 정보를 생성하고, 상기 생성된 발현량 정보를 기설정된 변환을 수행하는 단계;
상기 대상자 중 선택된 일부 대상자를 모델 생성 대상자군으로 하여 상기 변환된 바이오마커별 발현량 정보로 의사 결정 나무를 활용하여 복수개의 분류기(classifier)를 생성하고, 상기 생성된 복수 개의 분류기를 접합하여 적어도 하나 이상의 바이오마커가 참여하는 복수 개의 암 진단 모델 후보를 생성하는 단계;
상기 대상자 중 모델 생성 대상자군에 포함되지 않은 대상자를 모델 검증 대상자군으로 하여, 모델 검증 대상자의 변환이 수행된 상기 바이오마커별 발현량 정보로 상기 암 진단 모델 후보에 입력하고, 상기 모델 검증 대상자별 암 진단 정보를 생성하는 단계;및
상기 암 진단 정보에 대한 기 설정된 평가를 수행하고, 기설정된 평가 지표를 충족시키는 암 진단 모델을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 변환된 바이오마커별 발현량 정보를 사용하는 복합 바이오마커를 활용한 암 진단 모델을 생성 방법을 제시한다
[0036] 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 암 진단을 위한 적어도 2 이상의 바이오마커를 포함하는 복합 바이오마커 정보를 처리하는 암/정상 예측 통계 모델과 관련된 바이오마커별 변수값 처리 방법에 있어서,
적어도 2 이상의 샘플에 대하여 각 샘플별로 상기 바이오마커별 오리지널 변수값을 입수하는 단계;
상기 바이오마커별 오리지널 입력 변수값으로 기설정된 처리를 수행하여 상기 바이오마커별 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계를 구성하는 단계;
상기 바이오마커별 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계를 이용하여 상기 바이오마커별 오리지널 변수값에 대한 상기 바이오마커별 변환 변수값을 생성하는 단계;
상기 바이오마커별 변환 변수값을 기설정된 암/정상 예측통계 모델의 생성 또는 암/정상 예측 통계 모델의 실행에 사용하는 단계;를 포함하는 것이며, 상기 partial dependence plot 또는 partial dependence 함수 관계는 앙상블 기법을 활용한 것이며, 상기 앙상블 기법은 Boosting 알고리즘 기법과 Random Forest 알고리즘 기법 중 어느 하나 이상의 기법인 것을 특징으로 하는 바이오마커별 변수값 처리 방법을 제시한다.
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***이번에 소개하는 특허는 박데이터처리방법에 관한 새로운 기술 시스템 및 컴퓨팅장치에 관한 발명특허입니다.
***인공지능-머신러닝-딥러닝과의 관계를 3개의 원으로 구성된 동심원으로 비유하자면.... 인공 지능(빅데이터를 바탕으로 인간지능을 기계로 구현)이 가장 바깥의 큰 원이고, 그 안쪽에 위치한 다음 원이 머신 러닝(인공지능을 구현하는 방식...스팸을 자동적으로 걸러주는 방식...기본적으로 알고리즘을 이용해 데이터를 분석하고, 분석을 통해 학습하며, 학습한 내용을 기반으로 판단이나 예측 수행)이며, 현재의 인공지능 붐을 주도하는 딥 러닝(완전한 머신 러닝을 실현하는 기술...레이어 연결 및 데이터 전파 방향이 일정한 인공신경망 이용)이 가장 안쪽의 작은 원이라 할 수 있을 것..
===등록 [29] 특정 항목이 속하는 클래스를 예측하기 위한 2-클래스 분류 방법 및 이를 이용하는 컴퓨팅 장치.... 출원번호 : 1020100139567 출원일자 : 2010.12.30
----[0001] 본 발명은 특정 항목이 속하는 클래스를 예측하기 위한 2-클래스 분류 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 독립 항등 분포된(independently identically distributed) 샘플 데이터를 획득하고, 신규 준모수 로지스틱회귀 랜덤 포레스트 방법론(semi parametric logistic regression with random forests)을 통하여, (i) 모형식의 미지 모수를 추정하며, (ii) 랜덤 포레스트 모형(random forest model)을 이용하여 신규 데이터를 위한 예측식을 추정함으로써, 특정 항목이 속하는 클래스를 예측하는 방법 및 이를 이용한 컴퓨팅 장치에 관한 것이다.
----[0002] 분류(classification)는 항목들의 모음(예컨대 데이터 샘플들)을 분할하되, 측정 가능한 특성 또는 특징의 면에서 균질한 클래스(homogeneous classes)들로 분할하는 데에 이용되는 통계 처리(statistical process)를 의미한다. 일반적으로 말하자면, 전형적인 분류기(예컨대 분류를 수행하는 전산화된 시스템을 가리키나 종종 그러한 분류 방법론 자체를 지칭하기도 함)는, 우선, 가용한 트레이닝 샘플들의 집합에서 키 패턴(key pattern)을 인식하고 이에 표식을 달도록 훈련(train; 트레이닝)된다. 여기에서, 훈련이라고 함은, 분류기에 적합한 분류능력을 부여하기 위하여 반복적으로 계산하는 절차를 의미한다. 한번 훈련된 분류기는 향후 입력되는 데이터가 어느 클래스에 소속되는지를 예측하는 데에 이용될 것이다.
-----[0003] 분류에 있어서 최근의 괄목할 만한 진보 중의 하나가 랜덤 포레스트(random forest; RF) 방법론인데, 랜덤 결정 포레스트의 개념은 1995년에 벨 연구소의 틴 캄 호(Tin Kam Ho)에 의하여 처음 제안되었으며, 레오 브레이먼(Leo Breiman)에 의하여 확장되고 공식화되었다. 본원에서 "랜덤 포레스트", "랜덤 포레스트 방법론" 및 "RF"는 레오 브레이먼에 의하여 설명된 분류 개념을 의미하는바, 같은 이름의 소프트웨어 상품을 지칭하는 것이 아님을 밝혀둔다. 랜덤 포레스트는 데이터 샘플들을 분류하는 다수의 분류 나무들의 결정을 결합하는 데에 배깅(bagging)을 활용하는 머신 러닝의 비모수 앙상블 접근법이다. 달리 말하자면, 랜덤 포레스트는 서로 연관성이 약한 의사 결정 나무를 생성한 후에 이를 선형 결합하여 최종 학습기를 만드는 방법이다. 랜덤 포레스트는 예측력이 매우 높은 방법으로 알려져 있다. 또한 랜덤 포레스트는 무작위성(randomness)을 최대로 주기 위하여 부트스트랩과 더불어 독립 변수들에 대한 무작위 추출을 결합한다. 이 특징은 각 나무들의 예측값들이 비상관화(decorrelation)되게 하며, 결과적으로 일반화 성능을 향상시킨다. 무작위 추출은 노이즈가 포함된 데이터에 대해서도 포레스트를 강인(robust)하게 만들어 준다. 무작위 추출은 각 나무들의 훈련 과정에서 진행되며, 앙상블 학습법인 배깅과 무작위 노드 최적화(randomized node optimization)가 적용될 수 있다. 이 두 가지 방법은 동시에 사용되어 무작위적 특성을 더 증진시킬 수 있다
---같은 데이터에 의사결정나무 여러 개를 동시에 적용해서 학습성능을 높이는 앙상블 기법이 랜덤포레스트로서, 이는 특정항목이 속하는 클래스를 예측하는 머신러닝방법이다.
.....본 발명자는 종래에 (다른 연구자들에 의해 한번도)행해지지 않던 방식으로 로지스틱 회귀 모형에 랜덤 포레스트 방법론을 접목함으로써, 보다 정확한 2 클래스 분류를 가능하게 하는 2 클래스 분류 방법 및 이를 이용하는 컴퓨팅 장치를 제시하고자 함.
.....본 발명은 요구되는 계산량에 비하여 높은 정확도를 가지는 2 클래스 분류를 가능하게 하는 것을 다른 목적으로 한다....예를 들어 어떤 데이터가 특정 질병을 앓는 환자의 것인지 정상인의 것인지와 같이 2개의 클래스로 분류 가능한 경우에 그러한 분류를 정확하게 하기 위한 분류 방법을 제공하는 것을 한 가지 목적으로 한다.
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****다음은 실생활에서 온라인상에서 스마트폰을 이용하여 개인별, 맞춤형, 참여형, 또한 예방적인 정밀미래의학을 가능하게 할 것인가에 대한 기술적 접근에 대한 발명특허입니다....즉, 이 시스템이 (적용하는 고객그룹마다 이름은 달라질 수 있겠지만) 아이파인더시스템의 알고리듬을 각각의 상황이나 환경에 적응할 수 있도록 개량한 일명 홍길동다이어리, 또는 샤롯데플랫폼이라 할 수 있으며, 2018년4월부터 서비스 돌입예정입니다..... 지금은 서비스항목은 8대암으로 늘어나게 되었으니 6대암을 8대암으로 읽으시면 될 겁니다.
===공개 [2] 스마트폰을 이용한 암검진 보조서비스 제공방법 및 그 시스템
본 발명은 Elastic net 기법을 기본으로 한 Multi-stage 분석 알고리즘을 사용하여 휴대 단말기 사용자가 개인별로 6개암 위험도를 효과적으로 측정하고, 추가 정밀검사 필요성의 유.무 및 건강관리 등에 관해 의사와의 상담 지원 도구를 제공하는 방법으로서,
휴대 단말기 사용자가 자신이 폐, 간, 대장, 유방, 전립선, 위암 등의 6개암의 발병 위험도를 동시에 직접 측정할 수 있도록 휴대 단말기의 소정의 위치에 설정된 분석 알고리즘 시스템을 통하여 사용자의 개인별로 적합하게 선정된 단백질 바이오마커들의 혈청 내 농도의 측정값과 그 데이터를 원 값으로 이용하되 개인별 특성들 (예, 성별, 나이, 흡연유무 등 질병 관련 개인 특성)을 적용하여 차이점을 보정함으로 스마트폰에서 개인별 농도를 산출하고, 암 유무에 대한 민감도, 특이도, 위양성률, 위음성률, 양성예측도 및 ROC curve 등을 산출하여, 0 - 1까지 스코어로 암위험을 측정할 수 있어 정기적인 암검진과 건강관리에 적용할 수 있는 6개암 개인맞춤 진단보조장치를 구비한 휴대 단말기를 사용하여 간편하고 질 관리가 용이한 체외진단시스템, 원격진료 및 유헬스에 의한 건강관리 체계 가능한 검사시스템 및 일차의료 중심의 미래 지향적 의료체계 시스템의 확립을 위하여 암검진 보조서비스의 제공방법 및 그 시스템에 관한 것이다.
------본 발명은 세계적으로 초고령화 사회로 급변하고 있는 상황이며, 국내에서도 노인인구의 급증으로 암환자 발생빈도가 성인남자가 일생 동안 3명 중 1명, 성인여자가 4명 중 1명 발생하는 질병 사망 1위인 실정과 최근 의료기술의 발전은 고가의 맞춤진단 및 맞춤치료의 방향을 지향하고 있어 개인이나 국가의 보건의료 비용이 증가하는 문제의 해결을 위해서는 ‘치료 및 치유 중심의 의료’에서 ‘예방 및 조기진단 중심 의료’로 전환이 요구되고, 인간게놈프로젝트의 완성 이후 바이오마커의 발굴이 대단위로 활성화되고 미세물질을 탐지할 수 있는 마이크로센서 기술의 발달로 정교하면서도 많은 검체를 신속히 검사할 수 있는 "high throughput" 융합기술이 미래의 예방 및 조기진단 중심 의료를 가능하게 한다.
[0003] 본 발명에서 제안하는 암진단 보조 서비스는 분석 알고리즘 시스템을 사용하여 개인별로 6개암 위험도를 효과적으로 측정하고, 추가 정밀검사 필요성의 유.무 및 건강관리 등에 관해 의사와의 상담 지원 도구를 제공함으로써,휴대 단말기 사용자가 자신이 폐, 간, 대장, 유방, 전립선, 위암 등의 6개암의 위험도를 동시에 직접 측정할 수 있도록 휴대 단말기의 소정의 위치에 설정된 분석 알고리즘 시스템을 통하여 사용자의 개인별에 게 적합하게 선정된 단백질 바이오마커들의 혈청 내 농도를 측정하고 그 데이터를 이용하여 개인별 차이점을 보정하여 스마트폰에서 개인별 농도를 산출하고, 암 유무에 대한 민감도, 특이도, 위양성률, 위음성률, 양성예측도 및 ROC curve 등을 산출하여, 0 - 1까지 스코어로 암위험을 측정할 수 있어서 소비자 개인에게 6개암에 대한 정기적 암검진과 건강관리에 적용할 수 있는 편리하고 질관리가 용이한 서비스를 제공하는 것으로, 앞으로 스마트 암위험도 검사 분석 알고리즘이 설정된 휴대 단말기를 사용하여 간편하고 질 관리가 용이한 체외진단시스템, 원격진료 및 유헬스에 의한 건강관리 체계 가능한 검사시스템 및 일차의료 중심의 미래 지향적 의료체계 시스템의 확립을 위한 암검진 보조 서비스를 제공하기 위한 방법 및 그 시스템을 제시한다.
00배 경 기 술
[0002] 본 발명은 세계적으로 초고령화 사회로 급변하고 있는 상황이며, 국내에서도 노인인구의 급증으로 암환자 발생빈도가 성인남자가 일생 동안 3명 중 1명, 성인여자가 4명 중 1명 발생하는 질병 사망 1위인 실정과 최근 의료기술의 발전은 고가의 맞춤진단 및 맞춤치료의 방향을 지향하고 있어 개인이나 국가의 보건의료 비용이 증가하는 문제의 해결을 위해서는 ‘치료 및 치유 중심의 의료’에서 ‘예방 및 조기진단 중심 의료’로 전환이 요구되고, 인간게놈프로젝트의 완성 이후 바이오마커의 발굴이 대단위로 활성화되고 미세물질을 탐지할 수 있는 마이크로센서 기술의 발달로 정교하면서도 많은 검체를 신속히 검사할 수 있는 "high throughput" 융합기술이 미래의 예방 및 조기진단 중심 의료를 가능하게 한다.
[0003] 본 발명에서 제안하는 암진단 보조 서비스는 분석 알고리즘 시스템을 사용하여 개인별로 6개암 위험도를 효과적으로 측정하고, 추가 정밀검사 필요성의 유.무 및 건강관리 등에 관해 의사와의 상담 지원 도구를제공함으로써,휴대 단말기 사용자가 자신이 폐, 간, 대장, 유방, 전립선, 위암 등의 6개암의 위험도를 동시에 직접 측정할 수 있도록 휴대 단말기의 소정의 위치에 설정된 분석 알고리즘 시스템을 통하여 사용자의 개인별에게 적합하게 선정된 단백질 바이오마커들의 혈청 내 농도를 측정하고 그 데이터를 이용하여 개인별 차이점을 보정하여 스마트폰에서 개인별 농도를 산출하고, 암 유무에 대한 민감도, 특이도, 위양성률, 위음성률, 양성예측도 및 ROC curve 등을 산출하여, 0 - 1까지 스코어로 암위험을 측정할 수 있어서 소비자 개인에게 6개암에 대한 정기적 암검진과 건강관리에 적용할 수 있는 편리하고 질관리가 용이한 서비스를 제공하는 것으로, 앞으로 스마트 암위험도 검사 분석 알고리즘이 설정된 휴대 단말기를 사용하여 간편하고 질 관리가 용이한 체외진단시스템, 원격진료 및 유헬스에 의한 건강관리 체계 가능한 검사시스템 및 일차의료 중심의 미래 지향적 의료체계 시스템의 확립을 위한 암검진 보조 서비스를 제공하기 위한 방법 및 그 시스템을 제시한다.
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발명의 내용
해결하려는 과제
[0004] 본 발명은 최근 의료기술의 발전은 고가의 맞춤진단 및 맞춤치료의 방향을 지향하고 있어 개인이나 국가의 보건의료 비용이 증가하는 문제의 해결을 위해서는 ‘치료중심의 의료’에서 ‘예방 및 조기진단 중심 의료’로의전환이 요구되며, 대한민국의 보건 의료 행정 분야 중 세계적으로 주목을 받고 있는 “5대암 검진사업”도 암종별로 다양한 진단방법들이 동원되는 사업으로 진료인력, 검사기기, 진료환경 등의 차이에 따른 검진기술에 대한 질 관리(quality assurance)가 매우 어려운 점으로 지적되고 있으며, 암을 정밀하게 검출한다는 목적으로 건강인에 위해를 줄 수 있는 방사성 동위원소나 과도한 방사선 물질에 노출되는 검사 항목들(PET-CT, 장기별 CT등)이 포함되거나 정기적으로 검사를 받기에는 부적절한 검사가 대학병원, 검진전문병원, 종합병원 등의 대형병원에 의하여 특별한 규제없이 시행되고 있어 중환자나 수술환자 치료 목적의 대형병원이 고유 목적 이외의 분야에 인력과 경비 투입하게 되어 국가 경제효율성이 저하되며 선진국들과 비교하여 우리나라 검진과정에 과도하게 방사능 노출 의료기기를 많이 사용하고 있으므로, 미래의 암 검진 체계의 방향은 “예방 및 조기진단 기술”을 활용하여 보다 간편하게 다수를 대상으로 질 관리가 용이한 시스템을 구축하되 일단 암 발병 고위험군을 선택하고 2차로 소수에게 정밀검사를 시행함으로 다수가 위해를 받을 수 있는 현재의 검진시스템의 단점을 보완할 필요가 있다.
[0005] 본 발명은 미래 “진단중심 의료”로 이행하기 위한 혁신적 기술의 필요성을 절감하여 기존의 암표지자검사를 단일마커에서 다지표마커로 확대하고 결과분석에 고유의 정보분석 알고리즘 적용하여 혈액검사로 암 위험군을 효과적으로 검출하는 ‘스마트 암위험도 측정 시스템’을 개발하였으며, 미래에는 전자기기 및 통신시스템의 발달과 의료소비자 조합 등 건강관리 비지니스의 활성화가 가시화되므로 원격진료 및 유헬스에 의한 건강관리 체계 가능한 검사시스템이 요구되며, 조기진단을 위한 스마트 암위험 측정 시스템의 활용으로 건강한 사람으로부터 현재 암이 발생되었거나 암 발생위험이 높은 ‘암 고위험군’을 효과적으로 선별할 수 있으면 종합건강검진을 목적으로 대형병원을 먼저 방문하는 현재의 의료체계 불균형 현상에서 일차의료 중심의 미래 지향적 의료체계 확립에도 기여할 수 있어 일석이조의 효과 얻을 수 있는 암검진 보조서비스방법과 그 시스템을 제공한다.
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과제의 해결 수단
[0006] 최근 genomics, proteomics, epigenomics, peptidomics, metabolomics, micromics 등 분야에서 대단위 발굴기술이 발전하여 혈액을 활용하여 암을 조기에 진단하고자 하는 기술들이 봇물 터지듯 개발되고 발표되고 있고,
현재 의료기관에서 가장 널리 사용되는 자동화기기 이후를 대비한 MRM (spectrometry), NMR spectroscopy, aptamer arrayer 등의 새로운 임상의료기기의 출현이 준비되고 있지만, 현재까지 암검진과 암환자 모니터링에 가장 유용하게 사용되고 있는 임상의료기기는 단백 표지자를 검사하는 방법이 거의 유일한 방법이다. 또한 의료분야의 FDA 허가는 매우 엄격한 과정을 거치므로 SCI 급 의학저널에 발표되고 학문적으로 다수의 학자들로부터 검증된 암관련 단백표지자가 최근 20여년간 1,250개가 넘는데도 불구하고 그 중 10개 정도만이 FDA 승인아래 임상에서 사용되고 실정임을 고려할 때, 임상의료에 유용한 기술과 기법을 개발하는 데는 새로운 암표지자의 발굴도 중요하지만 발굴된 표지자를 어떤 전략으로 실용화할 지가 더 큰 숙제이다.
[0007] 유사한 기술로서 Epigenomic 기술은 아직 미국 FDA에서 승인한 진단 키트는 없고, 대표적인 methylation 검사법의 경우에도 PCR 증폭에 의존하니 재현성 등에 문제가 있고 methylation 기전이 다른 질병들에서는 잘 연구되어 있지 않아 암검진시 특이도에 문제가 있을 수 있다. 미국 FDA와 NIH가 공동으로 개발에 박차를 가하고 있는 MRM기술은 아직 수년간의 시간이 필요하고 특정 펩타이드를 인지할 수 있는 특이 항체 및 항체 유사물질들의 개발도 뒤따라야 하는 문제점이 있다. 최근 국립암센터에서 대장암 진단 기술로서 SK Chemical회사에 기술이전을 한Metabolomics 기술은 아직 광범위한 연구 분야가 아니어서 발굴된 메타볼릭 마커들의 과학적 특성이 밝혀지기에는 시간이 필요하고 FDA 승인에는 이러한 특성이 임상적 의학 지식과의 관련성까지 밝혀지길 원하기 때문에 임상허가가 용이하지는 않다. 앱타머를 이용해서 암진단에 활용하려는 Aptamer array 기술은 15여년 이상 진행되어왔고 대단위 자동화 분석기기도 개발이 되어 있는 상태이나 앞에 다른 기술들과 마찬가지로 발굴된 표지자들의 과학적 및 의학적 특성 분석이 충분치 않아 research 단계에 머물러 있는 실정이다.
[0008] 반면에 본 발명은 현재까지 국내외를 막론하고 임상에서 인정받아 폭넓게 사용되고 있는 단백표지자를 활용하고 다양한 암종을 0 - 1까지 스코어로 측정할 수 있어 암검진과 암관리에 적용할 수 있는 유일한 시스템이며, 상기 어떤 기술이든 다지표검사에는 필수적으로 분석알고리즘이 동시에 개발이 되어야 하는데 알고리즘 개발 기술 또한 많이 축적되어 새로운 표지자 추가 및 새로운 기타 장기의 암검진 추가 등에 유연하게 적용 가능하며, 가장 중요한 장점은 실제 임상에 바로 적용 가능하고 테스트 인원수가 증가하면 할수록 분석알고리즘도 더욱 정교해져서 타 기술이 임상에 늦게 진입하게 되면 수월성에서 차이를 보일 수 있다는 것이다.
[0009] 본 발명은 상술한 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서 (1) 자동마커 측정계에 의한 혈청 내 농도 측정기술 - 선정된 단백질 바이오마커들 (가령, AFP, CEA, CA19-9, CA125, PSA, ApoA1, ApoA2, TTR, B2M, IL-6, CRP,PAI-1 등)의 혈청 내 농도를 측정하고, 그 측정결과 스마트폰으로 전송하고; (2) 스마트폰이나 컴퓨터에서 개인별 농도를 산출하고 암 위험도를 검사하는 기술 - 데이터 알고리즘 최적화를 통한 데이터 변환, 전송된 데이터를 이용하여 개인별 특성에 따른 차이점을 보정(이미 축척된 광범위 데이터의 통계적 표준화와 과학적 참고문헌의 데이터로부터 추출된 자료 활용)하여 스마트폰에서 개인별 농도를 산출하고; (3) 개인별로 각자가 소지하는 다지표 암검사 카드를 사용하여 암 위험도를 검사하는 기술 - 산출된 개인별 농도를 바탕으로 암 유무에 대한 민감도, 특이도, 위양성률, 위음성률, 양성예측도 및 ROC curve 등을 산출하고, 그 산출결과를 스마트폰으로 전송하고; (4) 스마트폰에서 6개암 위험도 측정기술 - Elastic net 기법을 기본으로 한 Multi-stage 분석 알고리즘을 사용하여 개인별 6개암 위험도를 효과적으로 측정하며, 추가 정밀검사 필요 유.무 및 건강관리 등에 관하여 의사와의 상담을 지원하는 도구로서 0 - 1까지 스코어로 측정함으로써,스마트 암위험도 분석 알고리즘이 설정된 휴대 단말기를 사용하여 간편하고 질 관리가 용이한 체외진단시스템, 원격진료 및 유헬스에 의한 건강관리 체계 가능한 검사시스템 및 일차의료 중심의 미래 지향적 의료체계 시스템의 확립을 위한 암검진 보조서비스를 제공하기 위한 방법 및 그 시스템을 제시한다.
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발명의 효과
[0010] 본 발명에서의 회원ID/비밀번호는 신청자의 회원등록여부를 사전적 단계에서 미리 확인하여 불필요한 후속단계를 차단하며, 또한 등록된 거래내역정보의 목록코드 역할을 하여 바이오마커정보DB(13), 혈청정보DB(14), 생체정보DB(15), 알고리즘정보DB(16)와 보고서정보DB(17)에 등록된 수많은 거래내역정보의 목록작성에 소요되는 시간을 최소화한다. 특히, 본 발명의 거래방법은 모든 신청내역정보를 메인 서버(10)로 전송하여 상기 메인 서버(10)에서 회원정보DB(11), 불량거래정보DB(12), 바이오마커정보DB(13), 혈청정보DB(14), 생체정보DB(15), 알고리즘정보DB(16)와 보고서정보DB(17)에 등록된 정보와 비교하고 판단하기 때문에 정보보안의 신뢰도를 높일 수 있다.
[0011] 본 발명은 상술한 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서 (1) 자동마커 측정계에 의한 혈청 내 농도 측정기술- 선정된 단백질 바이오마커들 (가령, AFP, CEA, CA19-9, CA125, PSA, ApoA1, ApoA2, TTR, B2M, IL-6, CRP,PAI-1등)의 혈청 내 농도를 측정하고, 그 측정결과 스마트폰으로 전송하고; (2) 스마트폰이나 컴퓨터에서 개인별 농도를 산출하고 암 위험도를 검사하는 기술 - 데이터 알고리즘 최적화를 통한 데이터 변환, 전송된 데이터를 이용하여 개인별 특성에 따른 차이점을 보정(이미 축척된 광범위 데이터의 통계적 표준화와 과학적 참고문헌의 데이터로부터 추출된 자료 활용)하여 스마트폰에서 개인별 농도를 산출하고; (3) 개인별로 각자가 소지하는 다지표 암검사 카드를 사용하여 암 위험도를 검사하는 기술 - 산출된 개인별 농도를 바탕으로 암 유무에 대한 민감도, 특이도, 위양성률, 위음성률, 양성예측도 및 ROC curve 등을 산출하고, 그 산출결과를 스마트폰으로 전송하고; (4) 스마트폰에서 6개암 위험도 측정기술 - Elastic net 기법을 기본으로 한 Multi-stage 분석 알고리즘을 사용하여 개인별 6개암 위험도를 효과적으로 측정하며, 추가 정밀검사 필요 유.무 및 건강관리 등에 관하여 의사와의 상담을 지원하는 도구로서 0 - 1까지 스코어로 측정함으로써,스마트 암위험도 분석 알고리즘이설정된 휴대 단말기를 사용하여 간편하고 질 관리가 용이한 체외진단시스템, 원격진료 및 유헬스에 의한 건강관리 체계 가능한 검사시스템 및 일차의료 중심의 미래 지향적 의료체계 시스템의 확립을 위한 암검진 보조서비스를 제공하는 효과를 유발한다.
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***이번에 다루는 타이틀은 다음번 연재와 함께 엑소좀에 대한 발명특허입니다.
금일 다루는 특허내용은 세포내부에서 만들어져서 세포외부로 분비하는 엑소좀의 특성을 이용, 외래항원을 유전자 이입기법으로 암세포내로 도입시킴으로써, 목적한 바 외래 항원을 엑소좀으로 유도, 면역원으로 작용하게 함으로써 (면역체계의 감시에서 벗어났던) 암세포에 대한 면역반응체계를 변화/정상화, 암세포를 사멸시킬 수 있음에 대한 기술 발명 특허입니다.
특허2>>유전자 이입을 이용한 엑소좀의 제조방법 및 상기 엑소좀의 용도<2002년8월13일 출원>
출원번호 : 1020020047779출원일자 : 2002.08.13등록번호 : 1005193840000등록일자 : 2005.09.28공개번호 : 1020040015508공개일자 : 2004.02.19
본 발명은 특정 항원을 인위적으로 세포내에 도입하여 그 세포로부터 분리한 엑소좀(exosome)에 상기 도입한 특정항원이 안정하게 발현되어 세포 밖으로 방출되도록 하는 엑소좀 및 이러한 엑소좀을 활용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 엑소좀은 유전자 이입을 이용하여 외래 항원을 목표 세포주내로 도입하여 상기 도입된 항원이 안정하게 발현되어 목표 세포주의 엑소좀을 통하여 세포밖으로 방출되도록 하는데 그 특징이 있다.
본 발명에 따르면 유전자 이입에 의해 외래 항원을 종양세포의 엑소좀으로 유도하여 면역원으로 이용함으로써 쉽게 면역체계에 변화를 유도할 수 있는 효과가 있다.
***엑소좀은 원래 적혈구가 성숙되어가는 마지막 단계에서 불필요한 단백질을 제거, 배출하는 방법으로서, 그러한 단백질을 가지고 세포 밖으로 분비되어지는 50-90nm 크기의 컵모양을 띤 막구조의 작은 소낭을 가리킨다. 이러한 엑소좀은 전자현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하여 세포밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는 지는 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포 뿐만이 아니라 B-림프구, T- 림프구, 수지상세포, 혈소판, 대식세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 특히, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에서는 다낭체를 포함해 막구조를 가지는 세포 내 구획에서 항원 펩티드가 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 II 분자에 선적되기 때문에 이로부터 기원되는 엑소좀도 항원 펩티드-MHC 클래스 II 컴플렉스를 가지고 있다. 따라서, 엑소좀은 면역원(immunogen)의 수송체로 서 CD4+ T 림프구에 항원 펩티드를 제시할 수 있고, 그에따라 T 림프구의 증식과 같은 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 엑소좀에는 MHC 클래스 I, 열충격 단백질(HSPs ; heat-shock proteins) 등 면역 반응을 자극시킬 수 있는 능력을 가진 분자들이 농축되어 있기 때문에 자가면역 질환이나 종양 치료에 있어서 면역증강 또는 감소의 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 이입에 의해 새로운 단백질이 발현되는 엑소좀을 얻는 과정은 도1에 개략적으로 나타낸 바와 같이 단계별로 정리하면 다음과 같다.
(1) 인간 muc1 유전자를 pLXIN의 BamHI 사이트에 클로닝하여 재조합 백터를 얻는 단계
(2) 상기 재조합 백터를 PA317이라는 패키징 셀라인(packaging cell line)내로 도입하여 muc1 유전자를 포함하는 바이러스 파티클(virus particle)을 생산하는 단계
(3) 상기 바이러스 파티클을 목표 세포주에 형질감염시키는 단계
(4) 상기 형질감염된 세포를 초원심분리하여 엑소좀을 얻는 단계
이상의 (4)단계에서 얻은 엑소좀에 대하여 도입된 항원 유전자가 발현되고 있는지 확인하기 위하여 형광물질을 이용하거나 단백질 전기영동을 통해 분석한 결과, 도입해준 항원 단백질이 목표 세포주내에서 안정하게 발현하였으며 엑소좀에 존재하여 세포밖으로 방출됨을 확인하였다.
본 발명에서 인위적으로 도입된 외래 항원으로 Muc1이라는 종양항원 이외 다른 종류의 종양항원을 사용하여 그 적용범위를 넓힐 수 있다.
본 발명에 따른 엑소좀에 포함된 외래 항원은 단백질 3차 구조상의 변화(conformational change)나 분해(degradation)가 없는 원형 그대로의 단백질로서, 실제로 종양이 우리의 생체내에서 발생하였을 경우 면역체계에 노출되어지는 단백질의 형태 그대로이다. 따라서, 외래 항원을 이용하여 면역체계에 변화를 유도하고자 할 때 이러한 엑소좀이 상기 면역원의 운반체로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 엑소좀을 이용하여 단백질을 획득하는 방법은 지금까지 분리, 정제가 어려웠던 세포 표면에서 발현하는 막단백질, 거대 분자량을 지니거나 당잔기에 의해 변형되는 단백질, 접힘(folding) 과정이 복잡한 단백질들을 기능적, 구조적 손상 없이 자연상태로 분리, 정제하는데 활용할 수 있다.
이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명할 것이다. 그러나, 이하의 실시예는 단지 예시를 위한 것이므로 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어서는 안 될 것이다.
본 발명에 따르면 유전자 이입에 의해 새로운 단백질이 발현되는 엑소좀을 이용하여 종양백신 개발 시 백신의 기초 재료가 되는 항원단백질을 일일이 합성, 분리 및 정제해야 하는 시간적, 경제적 낭비를 획기적으로 줄일 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 따라 엑소좀을 이용하여 단백질을 자연 상태로 분리, 정제함으로써 단백질의 변형으로 인한 생체내 면역반응의 부작용 및 실험적인 오차들을 극복할 수 있는 효과가 있다.
---세포가 자체 생산가능한 거의 모든 물질들은 엑소좀에 담긴 형태로 세포밖으로 배출되어 나오게 되어 있으므로, 이를 이용해서 원하는 물질을 세포로 하여금 생산케 하는 생산공장으로도 사용할 수도 있고, 또한 세포가 생산하는 물질들을 분석이용한 진단법 개발도 가능하여 실제로 바인에서는 유방암환자대상으로 ANT2 siRNA를 동정하여 진단키트화 가능성을 연구한 발명특허가 이미 등록되어 있음...
---엑소좀은 대부분 진핵세포에서 분비되는 30~100nm크기의 생체나노입자(=나노소포)로 그 내부에 DNA, RNA, 펩타이드 등의 단백질, 지질로 이뤄진 정보를 담고 있다. 세포가 혈액내로 분비한 엑소좀은 지질구조막(원형질막)으로 둘러싸여 있어서 내부의 물질을 혈중 분해효소 등으로부터 안전하게 운반할 수 있도록 되어 있고, 인접세포 또는 원거리세포에 정보 전달, 통신 역할 도 하면서 세포주변의 미세환경에도 영향을 끼친다. 이전엔 단순히 세포의 배설물에 불과하다고 여겨졌던 엑소좀이 사실은 다양한 생체정보를 함유한 신호전달매개체라는 사실이 밝혀진 이후, 신약개발과 진단, 백신분야뿐 아니라 코슈메슈티컬 영역에 이르기까지 많은 분야에서 이를 접목시키려는 노력이 이루어지고 있다
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***T/Tn 범암종 자가항원들.....모든 암의 거의 90%이상에서 발현되는 자가항원들로서 건강한 조직 또는 암이 아닌 질병 조직에서는 발현 안됨........혈청검사나 면역조직학적으로 볼 때, 분화가 잘된 암종에서는 Tn보다 T가, 반면에 미분화성 암에서는 Tn이 T보다 고농도로 발현됨......결국, Tn의 농도는 원발암의 침습강도, 조기재발, 조기사망과 상호연관성이 입증되었다.
***본 발명에서 쓰인 산화 만난 T/Tn 암백신은 다음과 같은 특장점을 가지고 있다......T/Tn 항원이 다양한 암 세포주 차원에서 뿐 아니라, 암 환자 조직에서도 그 발현이 확인되었으므로, 본 발명의 산화 만난-T/Tn 암 백신은 ...적용되는 암의 종류가 한 종류에 국한되었던 기존의 항암제들과는 달리 다양한 종류의 암 종에 대하여 두루 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
##특허>>Ｔ/Ｔｎ과 산화 만난의 접합체 및 이를 포함하는 암 백신조성물
출원번호 : 1020030023276출원일자 : 2003.04.14등록번호 : 1009802460000등록일자 : 2010.08.31공개번호 : 1020040088864공개일자 : 2004.10.20
[초록]
본 발명은 산화 만난을 T/Tn 당 단백 항원에 접합시켜 제조한 산화 만난-T/Tn 접합체(conjugate) 및 이를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 암 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 산화 만난 T/Tn 암 백신은 체액성 면역뿐 아니라, 세포성 면역 및 T/Tn 항원 특이 메모리를 형성함으로써 암 재발 억제 효과만을 나타내던 기존 백신보다 효율이 높은 것으로 판명되는 바, 재발 억제 효과는 물론 암 예방용 효과도 기대할 수 있을 것으로 보인다. 또한, 본 발명은 T/Tn 항원에 특이적이면서도 면역보조제에 의한 부작용이 없어 T/Tn 항원 면역이 초래할 수 있는 자가면역(autoimmunity) 유도의 문제를 해결할 수 있는 장점이 있다고 하겠다.
발명의 목적
[발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술]
암으로 인한 사망은 우리 나라의 경우 사망 원인의 제 1 위를 차지하고 있고 선진국가들에서도 가장 중요한 사망 원인중 하나이다.
지금까지 암의 치료에 대한 노력으로 1950년대까지는 외과적 수술 요법, 1960년대에는 방사선 요법, 1970년대에는 항암 약물요법 등이 개발되어 사용되었다. 1980년대에 이르러서는 기초과학, 특히 면역학과 분자생물학의 급진적 발전에 힘입어, 면역 치료 요법과 유전자 치료 요법이 대두되기 시작하였고, 현재 많은 연구가 진행되고 있으나 기존 요법만큼 획기적인 성과를 얻는 데는 아직 미흡한 실정이다.
암 백신은 능동적 면역치료요법의 일종으로, 종양 세포가 지니고 있는 특이 항원을 면역원으로 이용, 바이러스 백신제법과 유사한 과정을 거쳐 암 환자에게 투여함으로써 암 특이 항원에 대한 체액 성 또는 세포 성 면역 기전을 활성화시켜 암 세포 살해에 연관된 환자 내 면역기능을 최대한 활용하는 치료 방법이다.
한편, T/Tn 당 단백질은 인체 M/N 혈액형 구분 물질의 전 단계 물질로서, 다양한 암 종 세포의 표면에서 발현되고 있는 종양 특이 항원의 일종이다(Dr. Georg F. Springer, Science , 1984, 224 (4654): 1198-206).
T/Tn은 당 단백질로 이루어져 있으므로, 아직까지 종양 항원의 주 연구 대상이 되고 있는 세포성 면역 활성을 유도하기가 상대적으로 어렵다. 그러나 암 유발 인자에 대한 연구가 지속됨에 따라 대부분의 암 표지 인자들의 성분이 당 단백으로 규명되고 있어, 항 T/Tn 암 백신 개발의 효용성은 점점 커지고 있는 실정이다.
이와 관련하여, 감소된 당화작용(glycosylation)에 의해 노출된 단백 부분이 암을 죽이는 세포살해 T세포(CTL)에 의해 인지될 수 있는 항원결정기(epitope)로 작용할 것으로 추측되고 있으나, 이러한 부분이 실질적으로 체내에서 반복적인 구조로 노출될 경우 Galα(1,3)Gal이라는 당 구조와 유사한 형태를 띠게 됨으로써, 사람 체내에 미리 존재하는 항 Galα(1,3)Gal 항체에 의한 '면역 일탈 현상'이 유발되어 항원 특이적 세포살해 T세포가 제대로 형성되지 못한다는 보고가 있다(Apostolopoulos V., Nature medicine , 1998, 4 (3): 315-320).
T/Tn 항원은 진행된 인간 유방암의 재발 방지에 효과적이고 안전하다고 알려져 있다(Slovin S.F. et al ., Proc Natl Acad Sci USA , 1999, 96 (10): 5710-5; Dahiya R. et al ., Cancer , 1992, 70 (6):1467-76; 및 Liu Y. et al. , J Biol Chem 1999, 274 (9):5861-7). 또한, T/Tn을 단독으로 이용하여 면역화하는 경우, 강한 체액성 반응 및 DTH (Delayed-type hypersensitivity) 반응이 나타났지만 종양 억제 효과는 나타나지 않았다고 보고된 바 있다(Springer G .F. et al ., Cancer Biother , 1994, 9 (1):7-15; 및 Springer G.F. et al ., J Mol Med , 1997, 75 (8): 594-602). 이에 따라, 담체(carrier) 결합, 항원 변형 및 항원 제시 세포(antigen presenting cells)의 적용을 통해 T/Tn 암 백신을 개선하고자 하는 시도가 보고되었다. 특히, 트리-Tn 글리코토프(glycotope)를 갖는 합성 다중 항원성 당단백질을 이용하여 항-T/Tn 종양 면역법이 개발된 바 있다(Bay S. et al ., J Pept Res , 1997, 49 (6): 620-5; 및 Lo-Man R. et al ., J Immunol , 2001, 166 (4): 2849-54).
기존 T/Tn 암 백신은 체액성 면역기전 증강에만 기반을 둔 백신으로서 첫 투여 후, 매 3 개월마다 백신 투여를 지속해야 하는 번거로움이 있다. 또한, 백신의 효율이 떨어져 반드시 외과적 수술에 의한 종괴 적출이 선행되어야 하며, 아직까지 그 적용 실적이 일부 환자들을 대상으로 실험실 수준에 그치고 있다.
한편, 다수의 알데히드를 포함하는 산화된 형태의 만난(mannan)을 종양 관련 항원인 MUC1과 접합시킨 산화 만난-MUC1 접합체는 포유동물에게 투여하였을 때 높은 수준의 Th1 사이토카인 및 세포 살해 T 세포(CTL)를 유도하고, 쥐에서 MUC1+ 종양 세포 투여에 대해 보호 활성을 나타내었으며(Apostolopoulos V. et al. , J Immunol , 1995, 15 5 (11): 5089-94; Apostolopoulos V. et al. , Vaccine , 2000, 18 (27): 3174-84; 및 Apostolopoulos V. et al ., Eur J Immunol , 2000, 30 (6): 1714-23), 원숭이에서는 체액성 및 세포성 면역 반응을 모두 유도하였고(Vaughan H.A. et al. , Vaccine , 1999, 17 (20-21): 2740-52)), 인간에서는 특정한 MUC1 항체 및 T 세포 반응을 유도하였다(Karanikas V. et al ., J Clin Invest , 1997, 100 (11): 2783-92; Karanikas V. et al ., Clin Cancer Res , 2000, 6 (3): 829-37; Karanikas V. et al ., J. Immunother. , 2001, 24 (2): 172-83)).
이와 같은 산화 만난-MUC1 접합체의 효과는 MUC1 유전자 이입 세포주를 대상으로 확인함으로써 그 연구 환경이 인공적이라 할 수 있겠지만, 본 발명의 산화 만난-T/Tn 접합체는 T/Tn 항원이 자연 발현되는 세포를 대상으로 확인하였다는 점에서 우수성이 있다.
본 발명자들은 기존 암 백신의 문제점을 해결하기 위해 연구를 계속한 결과, 산화 만난(oxidised mannan)을 면역 보조제(adjuvants)로서 T/Tn 항원에 접합시켜 체액성 면역에 의지해 재발 방지 정도의 효과를 나타내던 기존 백신을 보다 특이적이고 효율이 높은 세포성 면역체계에 기반한 백신으로 개선함으로써 본 발명을 완성하였다.
[발명의 구성 및 작용]
상기 목적에 따라, 본 발명은 일차적으로 산화 만난을 T/Tn 당 단백 항원에 접합시켜 제조한 산화 만난-T/Tn 접합체(conjugate)를 제공한다.
본 발명에서는 또한, 산화 만난-T/Tn 접합체를 약제학적으로 허용되는 담체에 현탁한 암 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 산화 만난-T/Tn 접합체는 통상의 방법에 따라 산화 만난을 T/Tn 항원 단백질과 접합시켜 제조할 수 있으며, 접합체에서 산화 만난과 T/Tn 항원의 비율은 중량비로 40:1 내지 160:1, 바람직하게는 70:1 내지 90:1이며, 가장 바람직하게는 80:1 내지 85:1이다.
본 발명의 백신 조성물은 면역 효과를 증가시키기 위해 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제 등의 면역 보조제를 추가로 포함할 수 있는데, 이 때 산화 만난-T/Tn 접합체:면역 보조제의 비율은 중량비로 2:3 내지 3:2일 수 있고, 1:1의 비율이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시 예에서는, T/Tn 백신의 적용 범위를 확인하고, 동물 실험 모델 구축에 필요한 T/Tn 항원을 발현하는 세포주 선택을 목적으로 다양한 인간 및 마우스 암 세포주들에서 항 T/Tn 항체 및 형광물질 접합된 항 마우스 또는 항 랫트 항체를 사용하여, 세포주 표면의 T/Tn 발현 정도를 유세포분석법(flowcytometry)으로 검색한 결과, 마우스 유선암 세포주인 TA3HA 세포주에서 T/Tn 항원 발현량이 가장 높음을 확인하였다(도 2a). T/Tn 발현이 마우스 세포주에서도 인간 세포주와 유사하게 확인되고 있는 바, 인간 적용 T/Tn 암 백신 개발을 위해 마우스 동물 모델링이 적정함을 더불어 확인할 수 있었다. 나아가서, T/Tn 항원의 발현이 다양한 암 세포주에서 확인되고 있는 바, 본 발명의 적용도는 실로 다양하다 하겠다. 세포주 차원에서 확인된 T/Tn 발현이 암 환자의 조직에서도 동일하게 확인이 되는지를 검사하기 위해, 유세포분석법에서 사용하였던 항 T/Tn 항체 및 과산화효소(Peroxidase) 접합된 항 마우스 또는 항 랫트 항체를 이용한 면역염색 결과, 다양한 암 조직에서 T/Tn 항원의 발현이 유세포 분석 결과와 유사한 수준으로 확인되었다(도 2b).
따라서, 조직적합성을 고려하여, TA3HA 세포와 동종인 마우스 균주 A 모델을 대상으로 T/Tn 단독, T/Tn+프로인트보조제(FA), KLH(keyhole limphet hemocyanin-T/Tn 접합체+FA, 산화 만난-T/Tn 접합체+FA 등의 면역원을 이용하여 실시한 동물 실험의 모식도는 도 3과 같다. 그 과정을 간략하게 언급하면, 각각의 면역원을 적정 수준으로 충분히 접합 또는 현탁한 후(총 200 ul), 6 주령 암컷 마우스 복강 내로 주사기를 사용하여 7일과 10일 간격으로 총 3회에 걸쳐 면역한다. 면역이 제대로 되었는지의 여부와 암 성장기간 동안 면역 효과가 지속되었는지를 확인하기 위해 최종 면역 3일 후와 최종 면역 5일 후 접종한 암 세포 성장 후 1개월, 두 시점에 항체접합효소발색반응(ELISA)을 통해 체액성 면역효과를 검색하였다(도 4a 및 4b). 그 결과 나타난 항 T/Tn 항체 형성율로부터 면역이 제대로 이루어졌음을 확인하였으며, 이러한 현상은 암 성장이 30일 이상 지속된 시점에서도 동일하게 관찰되었던 바, T/Tn 항원에 대한 체액성 면역이 암 성장 1개월 후까지 유지됨을 알 수 있었다.
최종 접종 5일 후에 TA3HA 암 세포를 생리식염수로 세척한 후 10 % FBS(Fetal Bovine Serum) 함유 배지에 현탁하여 마우스에 피하 주사한 결과, 산화 만난-T/Tn 접합체+FA를 면역원으로 사용한 그룹에서만 암 성장 억제 및 개체 생존률 향상이 유의적인 것으로 확인되었다(도 5).
세포살해 T세포 검색법(CTL assay)를 이용하여 암 성장 억제에 관련되는 기작을 세포성 면역 체계를 중심으로 검색하고, 이와 같이 면역에 의해 형성된 T/Tn 항원 특이 암세포 살해 기능의 메모리가 존재하는지를 세포살해 T 모세포 활성 검색법(CTLp activity assay)을 통해 검색하였다.
그 결과, 산화 만난을 면역 보조제로 도입함으로써 T/Tn 특이 세포성 살해 기작 및 메모리 형성이 매우 효과적으로 유도되었음을 알 수 있었다(도 6a 및 6b, 및 도 7).
결론적으로, T/Tn 항원 백신에 산화 만난을 면역 보조제로 도입함에 따라 현재까지, 체액성 면역에 의지해 수술 후 재발 방지 정도에 그 목적을 두고 시행되어 온 기존 백신 체계를 보다 특이적이고 효율이 높은 세포성 면역체계에 기반한 백신으로 개선할 수 있음이 입증되었다.
도 4a 및 4b 에 따르면, T/Tn+FA 또는 KLH-T/Tn 접합체+FA 그룹에서도 체액성 면역 형성은 성공적으로 수행되었음을 알 수 있었지만, 암 성장 억제는 관찰되지 않았으므로, 산화 만난을 면역보조제로 사용하는 것이 T/Tn 암 백신 개량에 매우 중요하며, 이러한 면역원 체계에 의해 체액성 면역의 효율 저하 문제가 세포성 면역을 활성화함으로써 극복될 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 이러한 면역 효과가 T/Tn 항원에 특이적이고, 면역보조제에 의한 부작용이 거의 확인되지 않고 있는 바, T/Tn항원 면역이 초래할 수 있는 자가면역(autoimmunity) 유도의 문제 역시 추가적으로 해결할 수 있을 것으로 기대된다.
나아가, 본 발명의 산화 만난-T/Tn 접합체 함유 백신 조성물은 기존의 암 재발 억제 기능은 물론 암 예방 백신으로도 사용할 수 있다.
상기 산화 만난-T/Tn 접합체를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 본 발명의 항암 백신 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염
및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜) 및 기타 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 생리 식염수, 식용유 등을 주사용 매질로 하는 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
본 발명의 백신 조성물은 멸균되고/되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다.
상기 백신 조성물은 유효 성분으로서 산화 만난-T/Tn 접합체를 사람을 포함하는 포유동물에 대해 0.025 내지 0.05㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.025 내지 0.05㎎/㎏ 체중의 양으로 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있으며, 40 ~ 57 주 간격으로 2회 추가 면역하여야 한다. 그러나, 백신 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하 는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[발명의 효과]
본 발명의 암 백신 조성물은 체액성 면역뿐만 아니라 세포성 면역 및 그에 따른 메모리를 나타내므로, 암 재발 억제용으로서뿐만 아니라 초기 발암 예방 백 신으로서도 적용할 수 있다. 또한, T/Tn 항원에 특이적이면서도 면역보조제에 의한 부작용이 없어 T/Tn 항원 면역이 초래할 수 있는 자가면역(autoimmunity) 유도의 문제를 해결할 수 있는 장점이 있다.
[추가 논문]T/Tn immunotherapy avoiding immune deviation.....Hye-Youn Son, Vasso Apostolopoulos, Chul-Woo Kim First Published October 19, 2016 ....International Journal of Immunopathology and Pharmacology
...체액면역과 세포면역 둘다 동시에 유도할 수 있는 암 면역치료는 암 치료면에서 매우 매력적임에 틀림 없다. 보고된 바에 의하면 체액면역의 과활성으로 야기되는 세포면역 저하(면역 치우침)는 종양 성장 억제에 장애가 된다고 하였다..저자들은 면역 치우침도 피하고 동시에 종양억제를 얻는, Thomsen-Friedenreich (T/Tn)-특이적 체액면역을 유도시킬 수 있는 가능성이 있는 여러 첨가물들을 연구조사해 왔고 그 결과를 보고한다.....
0형 혈액형인 한국의 건강인헌혈자의 혈청에서 T/Tn (9:1)항원을 추출해서 면역시키되, **1>T/Tn만으로, **2>T/Tn에 Freund Adjuvant를 혼합시킨 것(T/Tn+FA)으로, **3>또는 keyhole limpet hemocyanin을 중합시킨 T/Tn에 FA를 혼합한 것 (KLH-T/Tn+FA), 또는 **4>산화 만난을 중합시킨 T/Tn에 FA를 혼합한 것으로(ox-M-T/Tn+FA) 각각 면역을 획득시킨 후 각각의 경우에서 항체가 수준을 분석했다. 그 결과, **2> **3> **4>에서 항체가가 상승하였는 바......제일 높았던 것은 KLH-T/Tn+FA group이었지만, ox-M-T/Tn+FA로 면역시킨 마우스에서는 specific complement-dependent cytotoxicity(특이적 CDCC)가 나타났고, T/Tn-positive mammary adenocarcinoma cell challenge는 나타나지 않았다, 아로 볼때, ox-M-conjugated T/Tn vaccine mixed with FA 가 체액면역을 적절히 조절해 줌과 동시에 세포면역을 증진시켜서 종양성장을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다..
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##특허15>>유방암 진단을 위한 엑소좀 내의 ＡＮＴ2 ｍＲＮＡ의 이용방법
출원번호 : 1020110085047 출원일자 : 2011.08.25 등록번호 : 1013350340000 등록일자 : 2013.11.25 공개번호 : 1020130022204
본 발명은 유방암을 진단하는데 응용할 수 있는, 혈액 또는 혈장으로부터 분리된 엑소좀의 이용 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 adenine nucleotide translocator 2(ANT2) mRNA를 함유하고 있는 엑소좀의 이용 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑소좀은 혈액 및 혈장에서 분리될 수 있으므로, 비침습성 방법으로 습득할 수 있다. 또한 세포에서 생성되어 분비된 RNA를 포함하고 있기 때문에, 혈액내의 RNA 분해효소로부터 RNA를 보호할 수 있어 고농도의 mRNA를 포함하고 있다. 따라서 본 발명에 따른 혈액으로부터 분리된 엑소좀의 이용 방법은 비침습성이며, 고감도 및 고특이성 유방암 조기 진단법에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
===기 술 분 야
[0001] 본 발명은 혈액으로부터 분리된 엑소좀(exosome)을 이용하여 유방암의 발병 여부를 측정하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 adenine nucleotide translocater 2(ANT2) mRNA를 포함하고 있는 엑소좀의 이용 방법에 관한 것이다.
===배 경 기 술
[0002] 엑소좀은 대부분의 세포에서 분비되는 작은 형태의 소포체(membrane vesicle)이다. 이 엑소좀 안에는 그 세포에서 유래된 다양한 종류의 단백질, 유전물질(DNA, mRNA, miRNA), 지질 등이 포함되어 있는 것이 보고된 바 있다.
특히 혈청 내에는 과량의 RNA 분해 효소(RNase)가 존재하므로 세포로부터 분비되는 유전물질들이 쉽게 분해되어 측정하기 쉽지 않은 반면, 엑소좀 안에 존재하는 RNA의 경우에는 RNA 분해효소로부터 보호되어 안정적으로 존재하는 것이 알려져 있다. 이와 같이, 조직 유래 엑소좀은 엑소좀을 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.
[0003] 종양(Tumor)은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비정상적이고, 비제어적이며, 무질서한 세포증식의 산물로써, 이러한 종양이 파괴적인 증식성, 침윤 및 전이성을 가지게 되면 악성종양(malignant tumor)으로 분류하게 된다. 특히, 분자생물학적인 관점에서 볼 때 유전자의 변이에 의하여 발생하는 유전적 질환이라고 할 수 있다. 각각의 종양은 정상 세포에는 존재하지 않는 돌연변이 유전자를 평균적으로 50 내지 80개를 보유하고 있는 것으로 알려진바 있다. 이러한 돌연변이 유전자를 검출하는 현 기법으로는 생검 시료의 분석이 가장 일반적이다. 그러나 생검 시료의 분석은 침습성이기 때문에 대상체에게 유해할 수 있다. 또한, 제한 부위로부터 조직시료를 채취하기 때문에, 종양이 정상 조직 내에 분산되어 있는 경우에는 결과가 정확하지 않을 수 있다. 그래서 최근에는 혈액과 같은 체액을 순환하고 있는 돌연변이 유전자를 검출하는 비침습성 방법도 제기되고 있으나, 유전자의 복제수가 극도로 낮기 때문에 검출이 어렵다는 단점이 있다.
[0004] 종양 중 유방암은 조기 진단에 성공하면, 다른 악성 종양에 비하여 치료할 수 있는 확률이 높다. 현재, 가장 일반적으로 사용되는 유방암 진단 방법은 기계적인 검사를 통하여 유방에 존재하는 이질적인 조직을 검출하는 방법인데, 이러한 방법은 검사과정이 비교적 간단하다는 장점에도 불구하고, 진단 성공률이 높지 않아서 생검 시료의 분석과 같은 방법과 병행되어 수행되고 있다.
[0005] 따라서 비침습성이며, 고감도 및 고특이성으로 유방암을 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
발명의 내용
===해결하려는 과제
[0006] 본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유방암의 조기 진단에 응용될 수 있는 방법으로, 혈액으로부터 분리된 엑소좀을 이용하여 유방암의 발병여부를 측정하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 엑소좀에 포함된 adenine nucleotide translocater 2(ANT2) mRNA의 발현수준을 측정하여 유방암의 진행 여부를 확인하는 것을 그 목적으로 한다.
[0007] 그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
===과제의 해결 수단
[0008] 본 발명은 생물학적 시료로부터 엑소좀을 분리하는 단계, 및 상기 엑소좀 내의 ANT2(adenine nucleotidetranslocater 2) mRNA 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 유방암의 발병 여부 측정을 위한 엑소좀의 이용방법을 제공한다.
[0009] 본 발명의 일 구현예로, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청인 것을 특징으로 한다.
[0010] 본 발명의 다른 구현예로, 상기 ANT2 mRNA 발현 수준을 확인하는 단계는 엑소좀으로부터 ANT2 mRNA 분리 및 증폭에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.
[0011] 또한 본 발명은 혈청으로부터 엑소좀을 분리한 후, 상기 엑소좀 내의 ANT2(adenine nucleotide translocater2) mRNA의 농도를 측정하여 유방암 발병 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 키트를 제공한다
===발명의 효과
[0012] 본 발명에 따른 엑소좀을 이용하여 유방암을 진단하는 것은, 비침습성 방법이다. 또한 상기 엑소좀은 세포에서 생성되어 분비된 RNA를 포함하고 있기 때문에, 고밀도로 응집이 가능하며 혈액내의 RNA 분해효소로부터 RNA를 보호할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 혈액으로부터 분리된 엑소좀의 이용 방법은 비침습성이며, 고감도 및고특이성 유방암 조기 진단법에 응용할 수 있는 기술로 기대된다.
[0026] 유방암 환자의 경우 정상인에 비하여, ANT2 유전자의 발현이 7.3배 이상 증가되어 있으며, 특히 유방암 초기인 1기에 해당하는 환자의 경우에도 4.8배 이상 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며, 이는 통계적으로 유의한 수준이다. 상기 결과는 유방암 환자의 혈액에서 분리한 엑소좀은 ANT2 유전자를 고농도로 포함하고 있다는 것을 시사한다.
[0027] 전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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>>2016-07-28 보령제약 "유망 림프종 치료제 내년 전임상 돌입"=바이젠셀 지분 투자로 세포치료제 기술 확보
보령제약이 NK/T세포 림프종 재발 치료 후보물질(EBV-CTLs)을 확보하고 내년 전임상에 돌입한다. NK/T세포 림프종은 완치 후 2년 내 재발율이 75%에 이른다는 점에서 EBV-CTLs가 상업화될 경우 상품성이 클 것으로 기대된다.
보령제약(대표 최태홍)은 27일 가톨릭대학교 기술지주 제1호 자회사 바이젠셀(대표 김태규)과 투자 계약을 체결하고 T세포 입양면역치료제를 시작으로 면역세포치료제 개발 전략적 협업체계를 구축했다고 밝혔다.
바이젠셀은 T세포 입양면역치료제 생산기술을 보유한 세포치료제 전문기업이다. 말초혈액 유래 수지상세포에 종양 및 바이러스 항원을 탑재해 T세포를 자극, 항원 특이적인 면역세포치료제를 생산하는 플랫폼 기술을 보유하고 있다.
첫 번째 성과로 엡스타인 바 바이러스(EBV, Epstein Barr-virus) 특이적인 세포독성 T세포(CTLs, cytotoxicity T lymphocytes)의 상업화 임상을 준비하고 있다.
EBV-CTLs는 연구자 임상 결과가 국제학술지에 소개되면서 주목을 받았다. 지난해 5월 미국 유전자세포치료학회 공식저널 몰레큘러 테라피(Molecular Therapy)지에 발표한 논문에 따르면, 항암치료 및 자가이식을 받은 NK/T세포 림프종 환자 10명에게 EBV-CTLs를 투여한 결과 10명의 환자가 모두 생존하고 4년 무병 생존률이 90%에 달했다. 모든 환자를 5년 이상 장기추적조사(long-term follow up)한 결과다.
NK/T세포 림프종은 한국인 비호지킨 림프종의 약 6.3%에 해당한다. 아시아권에서 많이 발생하는 질병으로 완치 후 2년 내 재발율이 75%에 이르고 재발 이후에는 별다른 치료법이 없어 상당수가 사망하는 예후가 좋지 않은 질병이다. EBV-CTLs이 상용화될 경우 재발 가능성이 높은 환자에게 치료 기회 제공은 물론 완치까지 가능 할 수 있을 것으로 기대된다.
양사는 내년 전임상을 시작으로 개발단계 희귀의약품 지정을 통해 3상 조건부 허가를 목표로 개발에 들어갈 예정이다.
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특허3>>제니스테인을 유효성분으로 하는 ＮＫ／Ｔ－세포 림프종의치료용 약학 조성물<2003년05월30일출원>
출원번호 : 1020030034786 출원일자 : 2003.05.30 등록번호 : 1005196600000 등록일자 : 2005.09.29 공개번호 : 1020040102939 공개일자 : 2004.12.08
[초록]
본 발명은 NK/T-세포 림프종 치료를 위한 활성 성분으로 제니스테인 (genistein)을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 NK/T-세포 림프종 세포주 (NK/T-cell lymphoma cell line)인 Hank-1에서 미토콘드리아의 기능장애 및 Bcl-xL 단백질의 소실을 유도하여 케스페이즈-3 (caspase 3) 비의존적 방식으로 NK/T-세포 림프종의 성장을 억제함으로써 NK/T-세포 림프종을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 목적을 갖는 약제, 가공 식품, 기능성 식품, 음료 및 주류의 제조에도 이용될 수 있다........ 제니스테인은 Hank-1과 Jurkat에서 대조군에 비하여 세포자멸사를 각각 45.9%와 44.8%로 유도하여 다른 기존의 항암제보다 세포자멸사 유도능이 우수하였다
[발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술]
본 발명은 NK/T-세포 림프종 세포주인 Hank-1에서 미토콘드리아의 기능장애 및 Bcl-xL 단백질의 소실을 유도하여 케스페이즈-3 비의존적 방식으로 NK/T-세포 림프종의 성장을 억제함으로써 NK/T-세포 림프종을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 제니스테인 함유 조성물에 관한 것이다.
혈관 중심성 T-세포 림프종은 비강 부위에 주로 발생하며 동양인에게 흔하다 (Jaffe et al., Am. J. Surg. Pathol . 20: 103-111, 1996). 이 림프종은 면역염색에서 종양세포가 NK-세포와 T-세포의 표지자를 공유하고 있는 경우가 많아 NK/T-세포 림프종으로도 불리고 있다. 거의 대부분의 증례에서 엡스테인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus; EBV)가 발견되어 EBV가 중요한 원인인자 중 하나로 추정되고 있으며, 림프절 외에 피부, 연부 조직, 고환, 상부 호흡기계, 그리고 위장관을 잘 침습하는 특징이 있다. 초기 병기에는 방사선 치료에 잘 반응하여 예후가 좋으나, 전신질환으로 진행된 경우에는 항암화학요법에도 반응하지 않아 예후가 매우 나쁜 것으로 알려져 있다 (Liang et al., J. Clin. Oncol . 13: 666-670, 1995; Cheung et al., J. Clin. Oncol. 16: 70-77, 1998).
이러한 NK/T-세포 림프종의 분자 생물학적 특징에 대한 연구는 그동안 많이 진행되지 못했는데, 이는 상기 질환에 대한 개념이 최근에서야 정립되었고 이 종양에 대해 확립된 세포주가 많지 않았기 때문이다. 이러한 세포주 중 Hank-1 세포주는 카가미 박사 등에 의해 1998년에 확립된 인터루킨-2 (interleukin-2; IL-2) 의존성 비강형 NK/T-세포림프종이다 (Kagami et al., Br. J. Haematol. 103: 669-677, 1998). 면역 표지자 검사에 의하면 Hank-1은 CD56,CD2, CD3ε, TIA-1, 그랜자임 (granzyme) B, 그리고 HLA-DR에 양성이며 다른 T-세포 표지자에는 음성이다. 유전학적으로는 T 세포 수용체 β와 γ가 재배열되지 않으며 EBV는 단클론성으로 관찰되고 EBV에 대한 항원으로 제2형의 잠복기를 보이는 것이 본래의 NK/T-세포 림프종과 동일하다. 따라서, Hank-1은 NK/T-세포 림프종의 특성을 연구하는데 유용한 대상이다.
식물에서 기원한 제니스테인 (genistein)은 콩의 주요한 이소플라본 (isoflavone) 성분으로 에스트로겐 (estrogen)대치요법에 널리 이용되어 왔으며, 많은 역학적, 임상적 결과들에 의하면 고농도로 사용했을 때 유방암이나 전립선암, 그리고 그 밖의 많은 종양의 발생 및 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Paterson et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 179: 661-667, 1991; Barnes et al., J. Cell Biochem . 221: 81-87, 1995; Shao et al., Anticancer Res. 18: 435-439, 1998). 세포수준에서 제니스테인은 티로신 키나제 (tyrosine kinase)의 억제, DNA 토포아이소머라제 (topoisomerase) Ⅱ의 기능 억제 (Constantinou et al., Cancer Res . 50: 2618-1624, 1990; Morris et al., Mutat. Res . 405: 41-56, 1998), 세포주기의 진행 억제, 혈관 신생 억제 (Matsukawa et al., Cancer Res . 53: 1328-1331, 1993; Fotsis et al., Cancer Res . 57: 2916-292, 11997; Fotsis et al., Baillieres Clin. Endocrinol. Metab .12: 649-666, 1998) 등의 다양한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 제니스테인이 종양의 성장을 억제하는 기능은 특히 세포주기에서 G2/M 정지, p21의 유도 및 세포자멸사 (apoptosis)의 유도 (Bergamaschi et al., Leukemia 7:2012-2018, 1993; Edwards et al., Int. J. Oncol . 3: 583-588, 1999) 등과 관련되어 있다. 하지만 제니스테인이 세포자멸사를 유도하는 분자생물학적인 기전에 대해서는 일부 세포에서만 부분적으로 알려져 있다. 세포자멸사는 세포의 항상성을 유지하는데 매우 중요한 기전으로 세포자멸사가 조절되지 않는 것은 종양의 발생기전에 중요한 과정으로 알려져 있으며, 또한 치료의 목표로도 이용되고 있다.
세포자멸사는 형태학적으로는 세포의 수축, 염색질의 농축, 그리고 올리고뉴클레오좀 (oligonucleosomal) DNA 분절을 특징으로 한다 (Thompson, Science 267: 1456-1462, 1995; Cohen, Immunol. Today 14: 126-130, 1993).
이러한 세포자멸사의 핵심단계는 시스테인 (cystein) 단백질 효소의 일원인 케스페이즈들의 활성화 과정이다 (Salvesen et al., Cell 91: 443-446, 1997; Raff, Nature 396: 119-122, 1998; Green, Cell 94: 695-698, 1998). 이러한 케스페이즈들의 활성화와 세포자멸사의 유도에는 두 가지의 구별되는 기전이 알려져 있다 (Hsu et al., Cell 81: 495-504, 1995; Hsu et al., Cell 84: 299-308, 1996; Feinstein et al., Trends Biochem. Sci . 20: 342-344, 1995;Green et al., Science 281: 1309-1312, 1998; Yin et al., Nature 400: 886-891, 1999). 하나는 죽음 수용체와의 상보적 결합에 의한 케스페이즈 8의 활성화로서, 이러한 기폭제 케스페이즈의 활성화는 이후 케스페이즈 3과 같은 효과기 케스페이즈들을 활성화시킨다. 다른 하나는 많은 종류의 세포손상 자극이 미토콘드리아의 변화를 야기하여 미토콘드리아 막의 탈분극화와 시토크롬 C의 유리를 야기하고, 이렇게 유리된 시토크롬 C가 케스페이즈 9를 활성화하여 다른 효과기 케스페이즈들이 활성화되는 과정이다. 또한, bcl-2 가족 유전자는 세포자멸사를 조절하는데 있어 매우 중요한 역할을 담당하는데 (Adams et al., Science 281: 1322-1326, 1998), 이 bcl-2 가족 유전자는 보통 세포자멸사를 촉진시키는 (pro-apoptotic) 역할을 하는 것과 억제시키는 (anti-apoptotic) 역할을 하는 유전자들로 구성되어 있다. 상기 유전자들은 구조적으로는 서로 매우 유사하나 기능적으로는 상호 보완적으로 세포자멸사를 조절하는 역할을 담당하고 있다. 또한, 최근에는 상기 bcl-2 가족 유전자들이 항암제에 대한 저항성을 일으키는 기전에 관여함이 보고된 바 있다 (Minn et al., Blood 86: 1903-1910, 1995).
이에 본 발명자들은 많은 약제에 내성을 보이는 NK/T-세포 림프종의 치료에 유용하게 이용될 수 있는 천연 식품 또는 식물 유래 화합물을 검색하던 중, 제니스테인이 NK/T-세포 림프종 세포주인 Hank-1에서 미토콘드리아의 기능장애 및 Bcl-xL 단백질의 소실을 유도하여 케스페이즈-3 (caspase 3) 비의존적 방식으로 NK/T-세포 림프종의 성장을 억제함으로써 NK/T-세포 림프종을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
[발명의 효과]
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 제니스테인은 미토콘드리아의 기능장애 및 Bcl-xL 단백질의 소실을 유도하여 케스페이즈-3 비의존적 방식으로 NK/T-세포 림프종의 성장을 억제하여 NK/T-세포 림프종을 효과적으로 치료할 수 있다. |
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