양시영내과의원

##특허>>ANT2 siRNA를 함유하는 HER2 표적 항암제에 대한 내성 극복을 위한 조성물

출원번호 : 1020150004367출원일자 : 2015.01.12등록번호 : 1016815970000등록일자 : 2016.11.25공개번호 : 1020150086442공개일자 : 2015.07.28

본 발명은 ANT2 발현 조절을 통한 암세포의 세포사멸 유도 및 표적 항암제 내성 극복 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ANT2 siRNA를 유효성분으로 함유하는 HER2/neu 표적 항암제 내성 저해 및 민감성 증진용 약학적 조성물, 그의 항암 치료 보조제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 표적 항암제와 병용 투여시에 암세포에 대한 선택성이 높으면서 항암활성을 증진시키는 효능을 가져 항암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

[0001] 본 발명은 표적 항암제의 내성 극복 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ANT2 siRNA를 유효성분으로 함유하는 HER2 표적 항암제 내성 극복 조성물 및 이를 유효성분으로 함유하는 HER2 표적 항암제 내성 암의 치료용 조성물에 관한 것이다.

유전자 치료(gene therapy)는 DNA 재조합 방법을 이용하여 치료용 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜서 유전자 결함을 교정하거나 세포에 새로운 기능을 추가하여 인체 세포의 유전적 변형으로 인한 각종 유전질환, 암, 심혈관질환, 감염성 질병 및 자가면역질환 등을 치료하거나 예방하는 방법이다. 구체적으로는, 치료유전자(therapeutic gene)를 체내의 원하는 장기로 전달함으로써 세포 내에서 치료용 또는 정상 단백질이 발현될 수 있도록 유도하여 상기 질병들을 치료하는 방법을 유전자 치료(gene therapy)라고 한다. 기존의 화학요법은 세포에 대한 무차별적 공격으로 정상세포 및 암세포가 모두 영향을 받는 문제가 있었으나, 이러한 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료법에 비하여 우수한 선택성을 가질 수 있으며 다른 치료법으로 조절하기 어려운 질병의 치료를 개선함으로써 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 특정 표적인자만을 선택적으로 억제하는 표적 치료를 통해 기존의 화학요법으로 인한 부작용을 최소화할 수 있다는 장점이 있다.

[0007] 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포에 전달하여 높은 효율로 발현할 수 있도록 하는 유전자 전달기술이 필요하다. 유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로서, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량 생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달 및 지속적으로 유전자를 발현할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체 기술은 유전자 치료 기술의 핵심 요소로서, 현재 유전자 치료에 많이 이용되는 대표적 유전자 전달체로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 바이러스성 전달체와 리포좀 및 폴리에틸렌이민과 같은 비바이러스성 전달체가 있다.

[0008] 유전자 치료의 전략 중 종양세포를 제어하는 전략으로는 종양억제 유전자를 이용하는 방법, 종양 선택적 살상바이러스를 이용하는 방법, 자살 유전자를 이용하는 방법 및 면역조절 유전자를 도입하는 방법 등이 있다. 구체적으로 종양억제 유전자를 이용하는 방법은, 상당수의 암환자에서 유전자가 결핍 또는 변형되어 있는 p53과 같은 종양억제 유전자를 원형으로 인체에 전달하여 암을 치료하는 방법이며, 종양 선택적 살상바이러스를 이용하는 방법은, 암조직에서 변형되어 있는 종양억제 유전자의 활성을 이용하여 종양세포에서만 선택적으로 증식할 수 있는 바이러스 유전자 전달체를 인체에 도입하여 치료하는 방법으로서 두 가지 모두 종양세포를 직접적으로 사멸시키는 전략이다. 또한, 자살 유전자를 이용하는 방법 예를 들면, HSK-TK와 같은 감수성 유전자를 도입하여 종양세포의 자살을 유도하는 방법도 이와 같은 범주에 포함된다. 반면에, 면역 조절 유전자를 도입하는 방법은 항종양 면역반응을 증가시키는 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 4(IL-4), 인터루킨 7(IL-7), 감마 인터페론(γ-interferon) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 등의 유전자를 인체에 전달함으로써 T 세포를 매개로 하여 종양을 인식하도록 유발하거나, 종양 유발 단백질을 차단함으로써 세포 자살을 유도하여 간접적으로 질병을 치료하는 전략이다.

유방암 세포는 세포 표면에 발현하는 상피 성장 인자 수용체(EGFR : Epidermal growth factor receptor)를 통해서 세포 내에 특정 신호전달 체계를 활성화시켜서 세포의 증식, 생존, 다른 조직으로의 이동과 침윤을 가능하게 한다고 알려져 있다. 특히, EGFR 가운데 HER2/neu(HER2)의 경우 유방암 환자의 30% 정도가 암 세포 표면에 과발현하고 있다고 보고되어 있는데 HER2/neu가 과발현되어 있는 경우 분화도가 좋지 않고 치료의 예후가 나쁘며, 호르몬수용체에 음성을 나타내어 호르몬 치료요법의 적용이 힘들며, 항암치료에 대한 강한 내성(multi-drugresistance)을 나타낸다고 알려져 있다. 암세포 표면의 HER2/neu의 발현은 HSP90(Heat shock protein 90) 단백질에 의해 유지되며, HSP90 단백질은 ATP가 결합할 때 그 기능을 수행할 수 있는 것이 알려져 있다. HER2/neu를 통해서 활성화되는 대표적인 신호전달체계로는 PI3K/Akt 신호전달체계가 알려져 있으며, 이 신호전달체계의 활성이 유방암 세포의 증식, 생존, 다른 조직으로의 이동과 침윤에 관여한다고 보고되어 있다. 따라서 HER2/neu의 발현을 낮추거나 HER2/neu를 통한 신호전달체계의 활성을 방해하는 방법을 이용해서 유방암을 치료하고자 하는 많은 시도들이 이루어지고 있다. 대표적으로는, 유방암 및 위암의 치료를 위한 표적 항암제로 트라스투주맙(trastuzumab) 단일클론항체 치료제가 알려져 있다. 트라스투주맙 단일클론항체는 암세포 표면의 HER2/neu에 결합하여 세포매개 세포독성(ADCC, Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)에 의한 면역체계 활성화를 통해 항암효과를 나타낸다. 이러한 치료제는 HER2 양성 암의 치료에 현저한 효과를 입증했지만, 최근 내성 문제가 부각되고 있다.

[0011] 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이터(ADP/ATP translocator, ANT)는 미토콘드리아 내막(inner membrane, IM)에 존재하는 효소로서 외막(outer membrane, OM)의 VDAC(voltage dependent anion channel)를 통하여 세포질로부터 미토콘드리아 내부로 ADP를 전달(import)하고 전자전달계(electron transfer chain system)를 거쳐 생성되는 ATP를 세포질로 방출(export)하는 기능을 수행하는 효소로 알려져 있다.

[0013] 암세포에 대한 선택성이 개선되어 정상세포에 대한 부작용이 저감된 표적 항암제가 개발되어 임상에서 활발히 이용되고 있으나, 이에 대한 1차 내성 및 획득 내성이 보고 되고 있다.

[0014] 본 발명의 목적은 표적 항암제의 내성 극복 및 암세포에 대한 민감성 증진을 위한 약학적 조성물 및 이를 포함하는 효과적이고 부작용이 저감된 암 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

[0026] 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 HER2/neu 표적 단일클론 항체 및 이와 유사한 표적 항암제에 대한 암세포의 내성을 극복할 수 있다.

[0027] 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 HER2/neu 표적 단일클론 항체 및 이와 유사한 표적 항암제의 암 세포에 대한 민감성을 증대시킬 수 있다.

[0028] 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 ANT2 단백질의 발현을 저감시켜 효과적으로 암세포의 세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라, 종래 표적 항암제와 병용 투여할 경우 암 치료 효과를 향상시킬 수 있다.

##특허>>EGFR 표적 치료제에 대한 폐암의 치료 반응성을 예측하는 방법

출원번호 : 1020130060659출원일자 : 2013.05.28등록번호 : 1013846860000등록일자 : 2014.04.07

본 발명은, 표피성장인자 수용체(EGFR)를 표적으로 하는 약물에 대하여 비소세포 폐암 환자의 반응성 유무를 예측하여, 획득내성 환자의 치료효과를 높이는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 폐암 환자가 약물 치료제에 반응할 것인지의 여부를 미리 예측할 수 있어, 내성으로 인한 낮은 치료 성공율의 문제를 해결하는 동시에, 항암제 예후를 추정하고 향후의 치료방침을 결정하는데 유용하다.

[0001] 본 발명은, 표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR)를 표적으로 하는 약물에 대하여 비소세포 폐암 환자의 반응성 유무를 예측하는 방법에 관한 것이다.

[0002] 보다 상세하게는, ANT2(Adenine Nucleotide Translocator 2) 단백질 또는 mRNA의 발현 증가를 확인함으로써 표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR) 표적 약물에 내성을 보이는 비소세포 폐암 환자를 식별 또는 예측하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 전세계적으로 암 사망의 주원인이며, 폐암세포의 종류에 따라 비소세포(non-small cell) 폐암과 소세포(small cell) 폐암으로 나눌 수 있다. 폐암의 약 80%가 비소세포 폐암으로 분류되며, 선암종(adenocarcinoma), 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 및 대세포암종(large cell carcinoma)이 이에 속한다. 또한, 비소세포 폐암은 일반적으로 소세포 폐암 보다 다른 기관으로의 전이가 느리다.

[0008] 표피성장인자 수용체(EGFR)는 약 170kDa의 막단백질(transmembrane protein)로서 상피세포의 표면에서 발현된다. EGFR은 세포주기 조절인자인 티로신 키나제(tyrosine kinase) 군에 속하며, 세포외 도메인에 리간드(EGF 또는 TGF-α)가 결합하면 활성화되어 세포내 티로신 키나제 도메인의 자가 인산화 반응을 유도하고, 결국 신호전달경로를 통하여 세포증식 및 성장을 촉진하게 된다. 성장인자수용체 기능의 조절에 영향을 주거나, 수용체, 리간드의 과다발현을 유발하는 유전자 변형이 일어나면 발암으로 이어질 수 있다.

[0009] EGFR은, 종양유전자(oncogene)인 erbB 또는 ErbB1의 단백질 산물이다. erbB 또는 ErbB1은 수많은 암 발생에 있어 중요 인자로 알려진 원발암유전자(protooncogenes)인 ERBB 군의 하나이다. 폐암을 포함하여, 유방암, 방광암, 위암 등에서 EGFR의 발현이 증가되는 것이 관찰되었다. ERBB 종양유전자 군은 구조적으로 연관된 4개의 transmembrane 수용체들, 즉, EGFR, HER-2/neu(erbB2), HER-3(erbB3), 및 HER-4(erbB4)를 암호화하고 있다.

[0010] 폐암, 유방암, 방광암, 위암 등의 상피세포암을 치료하기 위하여 다양한 EGFR 표적 약물이 개발되었으며, 특히 게피티닙(Gefitinib)(AstraZeneca UK Ltd., 상표명 "IRESSA")와 얼로티닙(Erlotinib)(Genentech, Inc. & OSI Pharmaceuticals, Inc., 상표명 "TARCEVA")이 대표적인 약물이다. 게피티닙(Gefitinib)과 얼로티닙(Erlotinib)은 퀴나졸린계 화합물로서, EGFR의 티로신 키나제 활성을 저해하여 인산화를 억제함으로써 세포성장을 막는다.

[0011] 이들 표적 치료제들이 매우 유효한 약물임에도, 계속 사용시 치료효과들에 대하여 내성을 나타내거나, 측정가능한 정도의 반응을 보이지 않는 문제가 있다. 실제, 비소세포 폐암 환자들의 약 10% 정도만이 이들 약물에 반응성을 보이고 있다.

[0012] 이에, 본 발명자들은 암 환자의 항암제 내성 여부를 판단하여 특정 항암제에 대한 치료 반응성과 효과의 예측방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

[0013] 구체적으로, 본 발명의 목적은 폐암 환자의 게피티닙 치료에 대하여 ANT2를 신규의 내성 예측 바이오마커로 제공하는 것이다.

[0014] 그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

[0015] 본 발명은, 폐암조직 샘플에서 ANT2 단백질 또는 mRNA의 발현량을 확인하는 단계를 포함하는, 표피성장인자 수용체(EGFR)를 표적으로 하는 약물에 대하여 비소세포 폐암 환자의 반응성 유무를 예측하는 방법을 제공한다.

[0016] 본 발명의 일 구체예로, 상기 방법의 약물은 게피티닙(gefitinib) 또는 얼로티닙(erlotinib)인 것을 특징으로 한다.

[0017] 본 발명의 다른 구체예로, 상기 ANT2 단백질의 발현량은 면역조직화학염색, ANT2 mRNA의 발현량은 qRT-PCR을 이용하여 확인하는 것을 특징으로 한다.

[0018] 본 발명의 또 다른 구체예로, 상기 면역조직화학염색은 항-ANT2 항체를 이용하는 것을 특징으로 한다.

[0019] 본 발명에 의하면, 폐암 환자가 약물 치료제에 반응할 것인지의 여부를 미리 예측할 수 있어, 내성으로 인한 낮은 치료 성공율의 문제를 해결할 수 있다.

[0020] 또한, 본 발명에 의하면, 폐암을 치료하는데 사용된 약물에 환자가 반응적일지의 여부를 결정하여, 항암제 예후를 추정하고 향후의 치료방침을 정할 수 있다.

##특허>>아피제닌, 커큐민 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

출원번호 : 1020160111383출원일자 : 2016.08.31등록번호 : 1018030000000등록일자 : 2017.11.23

본 발명은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 아피제닌, 커큐민 또는 호노키올을 단독으로 처리할 경우 보다 혼합 또는 병용처리 할 경우에 서로 상승적으로 암 세포의 사멸을 유도하는 바, 본 발명의 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 항암 효과를 상승시켜 암 세포 사멸을 유도함으로써 매우 우수한 암 치료 증대 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 폐암의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다

암 치료를 위한 새로운 접근방법으로 독성이 비교적 낮은 천연물로부터 부작용이 적고 암 종의 전이를 억제하거나 감소시키는 효능이 뛰어난 발암 억제제 및 암 치료제를 개발하기 위한 노력이 계속되고 있으나, 이들 천연물 유래 치료제는 치료효과가 우수하지 못하다는 근본적인 단점이 해소되지 않고 있다

[0007] 이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 보다 안전하면서도 효과적으로 폐암을 치료할 수 있는 제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올 혼합물이 폐암 세포 주의 사멸을 일으키고, 암 세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하여, 폐암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

[0008] 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 아피제닌, 커큐민, 호노키올의 단독 또는 혼합 투여에 의한 폐암 세포 주의 해당 작용 속도 감소, ANT2 발현 억제, HK2 발현 억제, PD-L1 발현억제 및 ATP 생산을 감소 효과를 확인하고, 이에, 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

[0009] 이에, 본 발명의 목적은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

[0010] 또한, 본 발명의 다른 목적은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

[0011] 그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다

[0012] 상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[0013] 본 발명의 다른 목적은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

[0014] 본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 아피제닌 및 호노키올 혼합물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

[0015] 본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 커큐민 및 호노키올 혼합물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

[0016] 본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 ANT2 (Adenine nucleotide translocator 2) 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

[0017] 본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 HK2 (hexokinase 2) 또는 PD-L1 (Programmed death-ligand 1) 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.

[0018] 나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

[0019] 뿐만 아니라, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 폐암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

[0020] 본 발명은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 아피제닌, 커큐민 또는 호노키올을 단독으로 처리할 경우 보다 혼합 또는 병용 처리 할 경우에 서로 상승적으로 암 세포의 사멸을 유도하는 바, 본 발명의 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올 혼합물을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 항암 효과를 상승시켜 암 세포의 사멸을 유도함으로써 매우 우수한 암 치료 증대 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 폐암의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

[0022] 본 발명에 따른 조성물은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올 혼합물을 유효성분으로 포함하며, 폐암 세포 주의 해당 작용 속도 감소, ANT2 발현 억제, HK2 발현 억제, PD-L1 발현 억제 및 ATP 생산을 감소시켜, 폐암의 예방, 개선 또는 치료 효과를 확인한바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

[0026] 본 발명은 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 및 건강기능식품 조성물을 포함한다.

[0027] 본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 폐암 관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

[0028] 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 폐암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

[0029] 본 발명의 조성물에 의한 예방, 치료 대상 질병인 "암(cancer)"은 생체 조직 안에서 세포가 무제한으로 증식하여 악성 종양을 일으키는 질환이며, 보다 구체적으로 폐암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[0030] 본 발명에서 사용되는 "호노키올(honokiol)"은 폴리페놀계 화합물로, 목련종(Magnolia species)으로부터 분리, 정제 또는 추출될 수 있고, 보다 구체적으로 후박나무에서 분리, 정제 또는 추출될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 화학적으로 합성된 화합물 또는 상업적으로 판매되는 것 모두를 사용할 수 있다. 또한, 호노키올 유도체 또는 유사체일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

[0031] 본 발명에서 사용되는 "아피제닌 (apigenin, 5,7,4'-trihydroxyflavone)"은 플라보노이드 계열의 화합물로서, 아까시나무 추출물에서 발견될 뿐 아니라 오렌지, 사과, 체리, 포도 등의 과일과 양파, 파슬리, 샐러리, 보리, 토마토 등의 야채나 차, 와인 등의 음료에 풍부하게 존재하여, 이로부터 분리, 정제 또는 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 화학적으로 합성된 화합물 또는 상업적으로 판매되는 것 모두를 사용할 수 있다. 또한, 아피제닌 유도체 또는 유사체일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

[0032] 본 발명에서 사용되는 "커큐민(curcumin)"은 알칼로이드계 화합물로, 강황 또는 울금에서 분리, 정제 또는 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 화학적으로 합성된 화합물 또는 상업적으로 판매되는 것 모두를 사용할 수 있다. 또한, 커큐민 유도체 또는 유사체 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[0033] 또한, 본 발명에 따른 조성물은 아피제닌 및 호노키올 혼합물을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[0034] 또한, 본 발명에 따른 조성물은 커큐민 및 호노키올 혼합물을 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[0035] 또한, 본 발명에 따른 조성물은 ANT2 (Adenine nucleotide translocator 2) 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

[0036] 본 발명의 "ANT2(Adenine nucleotide translocator 2)"는 암 세포의 생존, 증식 및 전이에 있어서 중요한 기능을 가지고 있는 유전자이다. 아데닌 뉴클레오타이드 트랜스로카아제/트랜스로캐이터(ANT) 2 단백질은 미토콘드리아 내막에서 가장 많은 단백질이며, 여섯 개의 막관통 나선으로 형성되어 있다. ANT는 미토콘드리아 ATP에서 세포질 ADP로의 변화를 촉매 함으로써 세포 에너지 대사에서 중요한 역할을 하며, 이로써 미토콘드리아 산화적 인산화에 영향을 미친다. 모든 포유동물들은 ANT1 내지 ANT3의 아이소폼(isoform)을 가지고 있으며, 상기 아이소폼 패밀리인, ANT2는 인트라미토콘드리아 ADP로의 변환에서 해당과정에 의해 생산되는 세포질 ATP의 흡수를 증가시키는 것으로 보이며, 그 결과 마토콘드리아 막 전위를 유지할 수 있으며, ANT2의 결실(knockdown)은 암세포에서 막전위차를 감소시킨다.

[0037] 또한, 본 발명에 따른 조성물은 HK2 (hexokinase 2) 또는 PD-L1 (Programmed death-ligand 1) 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

[0038] 본 발명의 "HK2 (hexokinase 2)"는 6개의 탄소가 존재하는 6탄당을 인산화 시켜 6탄당 인산으로 전환시키는 효소로서, HK2는 정상세포에서는 발현양이 적으나 대부분의 암세포에서는 발현양이 매우 높으며, 포도당을 인산화 하는 기능과 더불어 미토톤드리아의 VDAC 단백질과 결합하고 세포사멸기전 (Apoptosis)을 저해하여 암세포의 생존력을 강화시키는 기능을 가지고 있다. 따라서 HK2를 표적으로 하는 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

[0039] 또한, 본 발명의 "PD-L1(Programmed death-ligand 1)" 단백질은 암 세포의 표면에 존재하는 단백질로서, 암 세포의 사멸 효과를 가지고 있는 T세포가, 암 세포의 표면에 있는 단백질인 PD-L1과 결합하면, T세포는 암 세포를 공격하지 못하여, 암 세포 사멸 효과를 잃게 된다. 면역항암제는 항체가 PD-L1 단백질의 결합을 막아 T세포가 스스로 암세포를 공격하게 만든다. 상기 항암제는 인체 면역시스템을 강화하는 것이어서 기존 항암제에서 생기는 부작용이나 내성이 없다. 따라서 암 세포의 면역 회피 전략의 하나로서 PD-L1의 발현 조절을 통해, 면역검문(immune checkpoint) 기능의 변화를 통하여 종양 특이 T림프구 세포의 기능을 억제할 수 있다.

[0040] 본 발명의 일 실시예에서는 폐암 세포 주에 호노키올, 아피제닌, 커큐민을 단독 또는 혼합 처리하여 암 세포의 사멸 효과를 확인(실시예 1 참조)하였으며, 호노키올, 아피제닌, 커큐민의 단독 또는 혼합 처리 시 폐암 세포주의 ANT2 발현 억제 효과(실시예 2 참조), ATP 생산 감소 효과(실시예 3 참조), HK2 발현 억제 효과(실시예 4참조), 해당작용 속도 감소 효과(실시예 5 참조) 및 PD-L1 발현 억제효과(실시예 6 참조)를 확인하였다.

[0041] 따라서 본 발명의 아피제닌 또는 커큐민; 및 호노키올을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 폐암 세포 주의 해당 작용 속도 감소, ANT2 발현 억제, HK2 발현 억제, PD-L1 발현 억제 및 ATP 생산을 감소시키는바, 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 유효성분으로도 이용될 수 있다.

[0042] 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

[0043] 본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

[0044] 본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 얄려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

[0045] 구체적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[0046] 또한, 본 발명의 조성물은 폐암 관련 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 폐암 예방 또는 개선 효과를 갖는 화합물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 화합물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

[0047] 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

[0048] 본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.

[0049] 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기로부터, 호노키올 + 아피제닌, 또는 호노키올 + 커큐민 혼합 투여에 의하여, ANT2 작은 간섭 RNA인 shRNA(short hairpin RNA) 또는 siRNA(short interfering RNA)에 의한 암 치료 효과와 유사한 치료 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

뿐만 아니라, 호노키올, 아피제닌, 커큐민 단독 또는 혼합 처리에 의한 ANT2 감소 효과는 작은 간섭 RNA를 이용하여 ANT2를 감소시켜, 암 치료를 시행할 때 갖게 되는 문제점인 siRNA 또는 shRNA의 체내로의 운반(delivery system)에 관한 문제를 해결 할 수 있을 것으로 기대된다.

##특허>>녹색 형광 단백질과 B f l -1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물

출원번호 : 1020040034598출원일자 : 2004.05.17등록번호 : 1005775120000등록일자 : 2006.04.28공개번호 : 1020040108553공개일자 : 2004.12.24

본 발명은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)과 항-세포사멸 단백질 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 약학 조성물은 항암제 또는 기타 세포 증식증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

출원번호 : 1020040034598출원일자 : 2004.05.17등록번호 : 1005775120000등록일자 : 2006.04.28공개번호 : 1020040108553공개일자 : 2004.12.24

본 발명은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)과 항-세포사멸 단백질 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

Bcl-2 상동성 (Bcl-2 homology, BH) 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 Bcl-2 패밀리 (family)에 속하는 단백질들은 세포사멸의 중심적인 조절인자로 널리 알려져 있다 (Adams JM, et al., Science 281(5381): 1322-1326, 1998).

Bcl-2 패밀리에 속하는 단백질들은 세포의 생존에 관여하는 효과에 따라 세포사멸을 촉진하는 단백질과 세포사멸을 억제하는 단백질로 나눌 수 있다. 세포사멸을 촉진하는 친-세포사멸 단백질 (pro-apoptotic protein)로는 Bax, Bak,Bok, Bcl-Xs, Bid, Bad, Bik 등이 있고, 세포사멸을 억제하는 항-세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)로는 Bcl-2, Bcl-xL, Bfl-1, Bcl-w, Mcl-1, E1B-19K, Ced-9 등이 있다.

세포사멸을 억제하는 단백질인 Bfl-1은 다양한 사멸 신호에 대하여 항-세포사멸 활성(세포사멸억제특성)을 갖는 것으로 알려져 있다. 특히, Bfl-1은 Reh 인간 B 림프구 세포 및 몰트-4 인간 T 림프구 세포에서 스타우로스포린에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하였다 (Ko JK, et al., Oncogene 22(16): 2457-2465, 2003; 및 Shim YH, et al., Int. J. Hematol. 72(4): 484-490, 2000). 이 경우에, Bfl-1은 Bid, 캐스페이즈 3, 캐스페이즈 8 및 캐스페이즈 9의 절단을 억제하고, 미토콘드리아의 막횡단 전위가 감소되는 것을 방지함으로써 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Shim YH, et al., Int. J . Hematol. 72(4): 484-490, 2000).

그러나, 세포사멸을 억제하는 항-세포사멸 단백질이라도 단백질 분해효소 (proteinase)에 의한 절단 등에 의해서 그 활성이 전환되어 세포사멸을 유도하는 경우가 있다. 예를 들어, 항-세포사멸 단백질인 Bcl-2 및 Bcl-xL은 세포사멸이 일어나는 환경에서 캐스페이즈-3에 의해 절단된다. 캐스페이즈-3에 의해 절단된 Bcl-2 및 Bcl-xL은 캐스페이즈들을 활성화시키고 시토크롬 c의 방출을 촉진시켜 세포사멸 활성을 나타내는 친-세포사멸 단백질로 전환된다 (Heng EH, et al., Science 278(5345): 1966-1968, 1997; 및 Clem RJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 554-559,1998).

최근의 보고에 따르면, Bcl-2 패밀리에 속하는 항-세포사멸 단백질과 친-세포사멸 단백질은 그들의 3차원 구조가 유사하다는 것이 발견되었다 (Schendel SL, et al., Cell Death Differ. 5(5): 372-80, 1998). 그러나, 구조적인 유사성에도 불구하고 이들이 어떻게 서로 다른 방식으로 세포사멸을 조절할 수 있는지에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀져 있지 않다.

본 발명자들은 Bcl-2 패밀리에 속하는 항-세포사멸 단백질인 Bfl-1이 GFP에 융합되어 항암활성을 나타내고 세포사멸을 효과적으로 유도하는 친-세포사멸 활성을 갖게 됨을 발견하고 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하는 약학 조성물이 암 및 세포 증식증의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 세포사멸을 유도하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 하는 항암제를 제공한다.

상기 GFP와 Bfl-1의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 세포사멸을 유도하기 위하여, 단독으로 투여되거나, 약학적 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 특히, 상기 유전자는 유전자 운반체에 삽입된 형태로 투여될 수 있으며, 유전자 운반체로서는 아데노바이러스가 바람직하다.

일반적으로 유전자 치료의 목적으로 사용되는 아데노바이러스는 높은 역가 (약 10 9 cfu/㎖)를 얻기가 용이하고, 감염시킬 수 있는 세포에 제한이 없으며, 바이러스 게놈이 세포의 염색체에 삽입되지 않고 목적하는 유전자를 발현하기 때문에 바람직하다.

상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있다.

상기에서 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 GFP가 융합된 Bfl-1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 세포사멸을 효율적으로 유도할 수 있으므로 항암제 또는 세포 증식증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

저자들은 Bfl-1의 N-터미널에 GFP를 융합시킨 융합단백을 만들어서 실험세포에 도입시켰다. 그 결과, 이 융합단백질은 미토콘드리아내로 들어가서 싸이토크롬C유리를 촉발함을 통해서 세포자살을 유도시켰는데, 이 세포자살현상은 Pan-Caspase억제제인 carbobenzoxy-Val-Ala-Asp-f;uoromethyl 케톤으로 유의미하게 차단할 수 있었지만 Bcl-xL이나 Bfl-1으로는 차단되지 않았다. 이를 통해서, 저자들은 세포자멸억제단백과 세포사멸촉진단백 사이에는 구조가 상당히 유사하더라도 반대로 작용한다는, Bcl-2패밀리에 속하는 단백질들의 구조적 기초지식에 대한 유용한 모델을 확립할 수 있었다..

>>2016.01.07 스톡옵션' 주고받을 때 꼭 챙겨야 할 6가지=[theL]"스톡옵션 부여총량에 유의하세요"---선수지 변호사(머스트노우)

스톡옵션(주식매수청구권)이란 회사의 입직원에게 장래 일정한 시기에 이르러 미리 예정한 가격에 회사가 보유하고 있는 자기주식 또는 새로 발행하는 신주를 취득 또는 인수하거나 이를 포기할 수 있는 권리를 말합니다.

기업 경영자 또는 임직원에게 현재의 낮은 가액으로 미래에 주식을 매수할 수 있는 권리를 부여함으로써 임직원들로 하여금 회사를 발전시키도록 동기를 부여하고, 회사는 추가 비용 지급 없이 인재를 유치할 수 있어 주주와 기업 모두에게 이익이 되는 제도로 많이 선호되고 있습니다.

스톡옵션을 주고 받고자 할 때 어떤 점을 유의해야 하는지 알아보도록 하겠습니다.

첫째, 스톡옵션을 부여하기 위해서는 회사 정관에 이에 관한 규정이 기재되어 있어야 합니다.

스톡옵션을 부여하기 위해서는 정관에 근거가 있어야 합니다(상법 제340조 제1항). 정관에 기재할 때 1)일정한 경우 선택권을 부여할 수 있다는 뜻 2)선택권의 행사에 응해 발행하거나 양도할 주식의 종류와 수 3)선택권을 부여 받을 자의 자격요건 4)선택권의 행사기간 5)일정한 경우 이사회 결의로 선택권을 취소할 수 있다는 뜻을 기재하여야 합니다.

회사가 직원에게 스톡옵션을 주고 싶다고 하여 제한 없이 부여할 수 있는 것은 아닙니다. 스톡옵션으로 발행할 신주 또는 양도할 자기주식은 비상장회사의 경우 주식발행총수의 10%를 초과할 수 없고, 상장회사의 경우 주식발행총수의 15%를 초과할 수 없습니다(상법 340조 의 제3항, 상법 제542조의3, 동법시행령 제30조 제3항).

그리고 벤처기업육성법에 따른 벤처기업의 경우 주식발행총수의 50%를 초과할 수 없습니다(벤처기업육성에 관한 특별조치법 제16조의3, 동법시행령 제11조의3 제6항). 주식발행총수는 위 스톡옵션을 정관에 규정하는 시점인지, 부여시점인지, 아니면 실제로 행사할 시점인지가 불분명하나, 규정의 취지와 분쟁 예방의 관점에 비추어 볼 때 정관에 규정할 당시뿐만 아니라 부여시점에서도 위 한도를 준수하여야 한다고 보아, 양 시점을 비교하여 주식발행총수가 적은 시점을 기준으로 하여 스톡옵션을 부여하는 것이 바람직해 보입니다.

셋째, 스톡옵션 부여 유형 및 정산방법에는 자기주식양도형, 신주발행형 및 차액정산 방식의 3가지가 있습니다. 첫 번째는 회사가 보유하는 자기주식을 예정된 가격으로 양수할 수 있는 권리를 부여하는 방법(자기주식양도형)이 있습니다(상법 제340조 제1항) 두 번째 방법은 주식매수선택권자의 선택권 행사에 응하여 회사가 행사가액을 발행가액으로 하여 신주를 발행하는 방법(신주발행형)이 있습니다.

한편 위 두 가지 유형으로 선택권을 부여하더라도 실제 선택권을 행사할 때 회사는 주식의 실질가액과 행사가액의 차액을 정산하여 금전 또는 차액상당 자기주식을 이전(차액정산)해 줄 수 있습니다.

넷째, 스톡옵션 부여는 주주총회 특별결의 및 계약서 작성으로 해야 합니다.

정관에 선택권을 부여하였다고 하더라도 실제 선택권을 부여하기 위해서는 주주총회 특별결의를 거치고 계약서를 반드시 작성하여야 합니다(상법 제340조의3 제3항, 제542조의2 제3항).

주주총회 결의에서는 1)주식매수선택권을 부여 받을 자와 행사 주식수를 특정하여야 하고 2) 주식매수선택권 부여방법으로 신주를 발행할지 회사 자기주식을 양도할지를 정하며 3) 위 스톡옵션을 부여 받은 자가 실제로 행사할 때 그 행사기간과 가액 및 위 스톡옵션 행사 전 추가 신주발행 또는 자본감소와 같은 사정이 발행할 때 위 행사가액을 증감할 수 있는지 그 변경사항을 정해야 합니다.

다섯째, 주식매수선택권은 선택권자가 선택권을 행사할 수 있는 기간(행사기간)을 도과해야 실제 행사할 수 있습니다. 상법상 스톡옵션 행사 가능기간은 주주총회 결의일(상장회사의 경우는 이사회 결의로 하는 경우 의사회 결의일)을 기산점으로 하여 2년 이상 회사에 재직 또는 재임하는 자여야 한다고 규정하고 있습니다.

따라서 주주총회 결의일로부터 2년 이상 재임∙재직하여야 행사할 수 있는데, 비상장회사의 경우 이 기간 전에 어떤 사유로든 퇴임 또는 퇴직하는 경우는 위 스톡옵션 권리를 상실하게 됩니다.

그러나 상장회사의 경우 위 기간 전에 사망 또는 그 밖의 본인의 책임이 아닌 사유로 퇴임∙퇴직한 경우에는 위 스톡옵션을 여전히 행사할 수 있도록 규정하고 있습니다(상법 제542조의3 제5항, 동법 시행령 제30조 제5항).

한편 상장회사는 위 스톡옵션을 부여받은 자가 본인의 의사에 따라 사임∙사직한 경우, 회사에 고의∙중과실로 손해를 입힌 경우, 회사가 파산한 경우, 계약상 특별한 취소사유가 발생한 경우 주식매수선택권 부여를 취소할 수 있습니다(상법 제542조의3 제5항, 동법 시행령 제30조 제6항).

여섯째, 스톡옵션 행사시점에 스톡옵션을 행사하려는 자는 스톡옵션 행사 주식 종류와 수가 기재된 청구서 2통을 작성하여 회사에 제출하여야 합니다(상법 제340조의5, 제516조의9 제1항).

이 때 회사는 이사회 결의로 위 청구를 받고 기존에 주주총회 결의에서 정한대로 스톡옵션을 부여할지 아니면 차액정산에 의할 것인지를 정할 수 있습니다.

이후 회사의 결정에 의하여 선택권의 행사가 가능해지면 스톡옵션 선택권자는 신주의 경우 행사가액 전액을 납부한 때에 주주가 되고, 회사 자기주식을 양수할 경우 위 주권을 이전받음으로서 주식을 취득하고, 명의개서 절차를 밟아야 회사에 대항할 수 있습니다.

선수지 머스트노우 변호사는 기업분쟁연구소(CDRI)에서 그간 기업소송을 주로 맡아 왔습니다. 앞으로 연재 칼럼을 통해 스타트업 분야의 이슈를 다룰 예정입니다.

스타트업 관계자들과 이야기를 나누면 자주 듣는 질문 중 하나가 스톡옵션의 세금문제입니다. 스톡옵션의 세금이슈는 부여하는 회사가 상장기업인지 비상장기업인지 혹은 벤처기업인지 그리고 부여시점인지 행사시점인지 혹은 행사 후 처분시점인지에 따라 ‘case by case’ 이므로 각 상황마다 세금이 달라 질 수 있습니다. 인터넷을 검색해보면 상장법인이나 벤처기업의 내용이 많아 더욱 어렵게 느껴지는데요, 대부분의 스타트업이 해당하는 일반 비상장기업을 기준으로 각 상황 별 스톡옵션의 세무이슈와 스타트업이 자주 묻는 내용을 설명하도록 하겠습니다.

스톡옵션 부여시에는, 회사와 직원 사이에 일정기간 거치 후 약정된 가액으로 주식을 매입할 수 있는 계약만 성립되었을 뿐 실현된 이익이나 손실이 없기 때문에 양쪽 다 세금을 내지 않으며, 세무이슈가 없습니다. 다만, 스톡옵션 부여시에는 상법상 부여요건을 충족했는지를 확인해야 하며, 특히 행사가격 결정을 위해 부여시 주식의 실질가격 산정이 필요할 수 있습니다. 주요 요건은 아래와 같습니다.

부여절차 ------------------주총 특별결의(이사회 위임불가) : <결의사항>부여받을 자의 성명, 부여방법, 행사가격과 그 조정에 관한 사항, 행사기간, 주식매수선택권 행사시 교부할 주식의 종류와 수

정관근거 -----------------스톡옵션을 부여하기 위해서는 정관에 반ㄷ즈시다음과 같은 내용이 기재되어 있어야 함(정관에 해당 내용이 없을 경우 주식매수선택권 부여를 위한 주총에서의 정관변경을 동시에 진행한후 실시) : *주식매수선택권부여가능...*주식매수선택권 행사로 발행하거나 양도할 주식의 종류와 수 *부여받을자의 자격요건 *행사기간 *일정한 조건이 불비시 이사회결의로 부여 취소가능..

행사가격 ------------------*신주발행의 경우에는 그 부여일 기준 주식의 실질가격과 그 주식의 액면가 중 높은 금액 *자기의 주식을 남에게 양도하는 경우에는 그 부여일 기준 주식의 실질가격

계약서 작성 --------------주식매수선택권을 부여받은 자와 계약을 체결하고 상당한 기간내에 그에 관한 계약서를 작성

A. 스타트업은 외부의 창업경험자나 해당분야 교수님 등 다양한 조력자의 도움을 받는 경우가 많습니다. 이 경우 현금여력의 부족 등의 이유로 스톡옵션 부여를 고려하곤 합니다. 일반적인 비상장기업의 경우 부여대상자가 이사·감사·피용자에 한정되어 외부의 조력자에겐 부여가 불가능합니다. 따라서 외부조력자에게 스톡옵션을 부여하고 싶다면, 비상근임원으로 등재시키는 방법을 고려 할 수 있습니다.

A. 최대주주 및 그의 배우자와 직계존비속, 주요주주(무의결권주를 제외한 지분율 10% 이상 주주) 및 그의 배우자와 직계존비속에게는 주식매수선택권을 부여할 수 없습니다. 그러나 당해 회사의 임원이 됨으로써 특수관계인에 해당하게 된 자(그 임원이 계열회사의 비상근임원인 경우를 포함한다)에게는 부여가 가능합니다.

------[법인세법 시행령제20조]<성과급 등의 범위>제1항3호--------

------[법인세밥 시행구칙 제10조의 4<주식매수선택권 등의 범위>--

벤처기업이 아닌 일반 비상장회사는 창업자(중소기업 창업 및 사업개시 후 7년 이내), 신기술사업자, 부품ㆍ소재전문기업에 해당하는 경우에 한하여 스톡옵션 행사에 따른 주식보상비용을 손금(비용)으로 처리할 수 있습니다. 즉, 회사는 스톡옵션 행사로 인해 발생한 주식보상비용을 손금으로 인정받아 과세소득이 줄어들게 됩니다. 다만 스톡옵션 부여유형에 따라 그 손금의 귀속시기가 달라집니다.

직원은 스톡옵션을 행사하게 되면, 행사일이 속하는 연도에 옵션행사이익에 대한 소득세를 납부하여야 합니다. 옵션행사이익은 ‘주식의시가 – 실제매수가액(행사가액)’로 계산되며, 직원의 다른 소득을 합하여 계산되는 각자의 소득세 과세표준에 따라 적용되는 세율이 달라집니다.

또한, 근무하는 기간 중 스톡옵션을 행사하여 얻은 행사이익은 근로소득으로 보아 연말정산에 반영되며, 근로소득 외 다른 종합소득이 추가로 있는 경우에는 5월에 종합소득세를 신고∙납부해야 합니다. 만약 근무기간 중 스톡옵션 가득을 완료하고, 퇴사 후 스톡옵션을 행사하는 경우 행사이익은 기타소득으로 보아 원천징수(22%) 된 후 다음연도 5월에 종합소득세에 합산하여 신고∙납부해야 합니다.

Q. 옵션행사이익 계산시 비상장주식의 경우 주식의 시가는 어떻게 알 수 있나요

A. 비상장주식의경우 실질가액 산정방법을 정한 명시규정이 없어 상속세및증여세법(상증법)에 따른 주식의 평가액을 시가로 보고 있습니다. 상증법상 시가는 예측가능성과 법적안정성을 해치지 않도록 발행법인의 순자산가치와 순손익가치에 의해 평가하는 방법을 정하고 있습니다. 따라서 재무제표와 세무조정계산에 기초하여 법에 정해진 방법대로 계산할 수 있으며, 일반적으로 회계법인, 세무법인, 회계사무소, 세무사무소에서 평가업무를 대행합니다.

A. 흔히 스톡옵션에 대한 절세전략으로, 스톡옵션을 한번에 행사하지 말고, 나누어서 행사하라는 조언을 합니다. 이는 소득세가 과세표준에 따라 5단계(2017년부터는 6단계)의 세율 구간이 있기 때문인데, 스톡옵션을 한번에 행사하여 소득이 높아져 세율구간이 달라지는 경우에는 세율구간이 달라지지 않는 범위 내에서만 스톡옵션을 일부 행사하면 절세효과를 얻을 수 있습니다.

* 상기 내용은 삼정KPMG의 공식 의견은 아니며, 스타트업의 이해를 돕기 위해 일반적인 내용을 기술하였습니다. 기업의 상황마다 다를 수 있으며, 구체적 사실판단이 필요한 사안의 경우 담당 회계사의 자문을 받길 권유드립니다.

올 상반기 기업공개(IPO) 대어 중 하나는 2조 6617억원을 공모한 모바일 게임회사인 넷마블게임즈였다.

넷마블 상장 직후 주식매수선택권(스톡옵션)을 받은 직원들도 '돈방석'에 앉게 됐다는 기사들이 많이 나왔다. 기사에 따르면 스톡옵션 행사로 취득할 주식의 규모는 공모가(15만7000원) 기준으로 약 2278억원에 달하는 규모라고 한다.

넷마블 직원을 약 600명으로 단순 계산하면 1인당 평균 3억8000만원어치의 주식을 받을 권리가 있는 것이라고 한다. 이러한 성공한 벤처기업, 스타트업에게 스톡옵션 제도는 임직원의 동기부여 수단 중 하나가 된다. 그렇다면 스톡옵션을 부여받은 임직원은 언제 어떤 세금을 얼마나 내야 할까

스톡옵션이란 회사의 설립·경영과 기술혁신 등에 기여하거나 기여할 수 있는 회사의 임직원에게 부여되는 것으로 미리 정한 가액(행사가액)으로 신주를 인수하거나 회사의 자기주식을 매수할 수 있는 권리다.

스톡옵션은 행사차익을 보상하는 방식에 따라 행사가격으로 신주를 발행하는 신주발행형, 회사가 보유하고 있는 자기주식을 행사가격으로 교부하는 자기주식양도형, 행사시점의 주식의 시가와 행사가액의 차액을 회사가 현금으로 지급하거나 그 차액에 상당하는 자기주식을 양도하는 차액보상형이 있다.

상장사는 현금으로 정산하는 차액보상형 스톡옵션을 부여하기도 하나 자금력이 부족한 벤처기업, 스타트업은 주로 신주발행형 스톡옵션을 임직원에게 부여한다. 아래에서는 신주발행형 주식매수선택권을 기준으로 스톡옵션의 각 단계와 세금에 대해서 설명하도록 하겠다.

스톡옵션은 크게 3단계로 구분할 수 있다. 먼저 회사가 임직원에게 스톡옵션을 ‘부여’하는 단계다. 일반적으로 회사는 특정 임직원에게 2년이상 재직하는 경우 2년 이후 특정가격(행사가격)으로 일정한 주식수의 주식을 살 수 있는 권리를 부여한다. 이 단계에서는 임직원에게 세금이 부과되지 않는데 이는 임직원은 스톡옵션이라는 권리를 부여 받은 것이지 이익이 발생한 것은 아니기 때문이다.

두번째로 스톡옵션을 보유하고 있는 임직원이 스톡옵션 즉 권리를 ‘행사’하는 단계다. 행사 단계에서는 스톡옵션을 행사하는 임직원은 자신에게 부여된 스톡옵션을 행사하고 신주를 교부 받게 된다.

이 때 행사자는 스톡옵션 주식수에 행사가격을 곱한 금액을 회사에 납입해야 한다. 스톡옵션 행사자는 스톡옵션을 행사하여 취득한 주식의 행사시점 시가와 행사가격과의 차액에 대하여 세금을 내야 한다. 세법은 이를 주식매수선택권 행사이익이라고 칭한다. 이 행사이익은 기본적으로 근로소득으로 과세되며 만약 퇴직 전에 주식매수선택권을 부여 받은 자가 퇴직 후 행사함으로써 얻은 이익은 세법상 기타소득으로 과세된다.

여기서 문제가 되는 것은 스톡옵션 행사로 부여 받은 주식을 매각하기 전까지는 현금을 수취하지 않기 때문에 소득세 납부가 부담이 된다는 점이다. 행사자 입장에서는 이 행사이익은 미실현 이익이라 할 수 있다.

또 경우에 따라서 회사가 파산, 경영상태 악화 등으로 회사 가치가 떨어지는 경우 스톡옵션 행사시점에 납부한 세금을 돌려받을 수 없다는 점이 문제가 된다. 즉 스톡옵션 행사자는 행사금액과 세금이라는 두가지 자금부담에 직면하는데 이런 부담 때문에 스톡옵션의 행사 자체를 포기하는 경우도 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해 조세특례제한법에서는 특정요건을 만족하는 주식매수선택권을 부여 받은 경우 스톡옵션 행사 이익에 대한 세금을 5년간(과거 3년) 분할해 납부할 수 있는 특례 규정(조세특례제한법 16조의2)을 두고 있다.

그리고 일정요건을 만족한 적격스톡옵션의 경우 행사시점이 아닌 스톡옵션 행사로 취득한 주식을 양도하는 시점에서 양도소득세를 과세하는 규정(조세특례제한법 16조의3)을 두고 있다. 스톡옵션을 부여하는 회사와 부여 받은 임직원들은 조세특례제한법 적용해 과세를 이연할 수 있는지 반드시 검토해야 한다.

마지막으로 스톡옵션 행사로 취득한 회사의 주식을 ‘양도’하는 단계다. 스톡옵션 행사자 입장에서는 양도단계가 되어야 비로소 스톡옵션으로 이익을 실현할 수 있게 되고 이 때 양도소득세를 납부해야 한다.

양도 단계에서는 비상장주식인 상태에서 양도하느냐 또는 상장 후에 양도하느냐에 따라 양도소득세가 달라지게 된다. 비상장주식인 상태에서 양도를 하면 양도가액에서 스톡옵션 행사 당시의 시가 (취득가액)을 차감해 계산한 양도차익에 대하여 11%(대주주인 경우 22%)의 세율로 양도소득세를 내야 한다.

서두의 넷마블의 사례처럼 상장 후에 주식시장에서 장내 거래를 하는 경우에는 양도소득세가 비과세 된다. 다만 대주주에 해당하면 양도소득세를 납부해야 한다.

그렇다면 모든 벤처기업, 스타트업, 중소기업은 주식매수선택권 제도를 활용해야 할까

그렇지 않다. 스톡옵션 제도는 궁극적으로 스톡옵션을 부여 받은 임직원이 스톡옵션 행사로 취득한 주식을 양도할 수 있어야 의미가 있기 마련이다. 만약 회사가 상장 계획이나 회사를 매각할 계획을 갖고 있지 않다면 스톡옵션 부여는 임직원에게 의미가 없을 뿐만 아니라 대주주에게도 배당, 지분 희석 등 불필요한 문제를 야기할 수 있다. 따라서 스톡옵션을 부여할때 회사의 성장 계획과 밀접한 관계가 있음을 반드시 유념해야 한다.

>>2016-12-04 비상장 벤처 스톡옵션, 시가보다 낮게 발행 가능==행사가격 하한 규제 풀려//액면가~시가서 행사 가능//우수인재 영입 기대 커져

비상장 벤처기업은 앞으로 스톡옵션(주식매수선택권)의 행사가격을 시가 이하로 정할 수 있게 된다. 벤처기업들이 우수 인재 확보를 위해 스톡옵션을 지금보다 더 적극적으로 활용할 수 있게 됐다.

중소기업청은 ‘벤처기업 육성에 관한 특별조치법’ 시행령 개정안이 5일부터 공포 즉시 시행된다고 4일 발표했다. 이번 개정안에서 가장 주목되는 부분은 스톡옵션의 가격 규제를 완화한 것이다. 지금까지는 비상장 벤처기업이 스톡옵션의 행사가를 시가와 액면가 중 높은 것으로 정해야 했다. 예컨대 액면가 500원인 비상장 벤처 A기업이 벤처캐피털을 상대로 주당 1000원짜리 주식을 발행해 투자를 유치했다면 스톡옵션 행사가는 1000원 이상이 됐다. 하지만 앞으론 500원 이상으로만 하면 된다. 행사가를 액면가 이상, 시가 이하에서 정할 수 있게 바뀌어서다.

다만 시가 이하로 받은 스톡옵션에 대해선 행사 이익을 근로소득세에 포함해 세금을 납부하게 했다. 시가 이상으로 받았을 땐 지금처럼 근로소득세와 양도세 중 유리한 것을 선택해 납부하면 된다. 벤처기업협회 관계자는 “미국 등 벤처 투자가 활성화된 국가에선 기업 이사회에서 자율적으로 스톡옵션 행사가를 정하기 때문에 수백억원의 대박을 내는 일도 종종 있다”며 “벤처기업이 우수 인재를 영입할 때 스톡옵션을 강력한 인센티브로 제시할 수 있을 것”이라고 말했다.

한국벤처투자조합의 출자자 수 규정도 완화됐다. 벤처펀드가 사모펀드 요건을 충족하기 위해선 투자자를 49인 이하로 해야 한다.